3. 总RNA提取,电泳鉴定及RT-PCR.pptVIP

实验二、 RNA提取及RT-PCR;实验内容 1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 2、RNA的琼脂糖凝胶电泳 3、以RNA为模板进行RT-PCR 4、 PCR产物的电泳及回收;实验一. 提取小鼠肝脏组织的RNA; 一、真核细胞的总RNA 1、mRNA: 1-5% 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt;二、RNA提取的注意事项 ;1)发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。 将1 mL Trizol 试剂移入Eppendorf管中。 2)实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大, 放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1 mL Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上。使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4)室温孵育10 min。;1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。;RNase抑制剂;5)加入200 ?l氯仿，震荡混匀20-30 s， 　室温放置5 min （此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体）。 6)10000 rpm， 离心 5 min;8) 沉淀RNA： 加0.5 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温10 min。 10, 000?rpm，4?C，离心10 min．弃上清。 ９) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。 (注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀) 10) 7500rpm，4?C 离心 1 min，弃上清． 再离心几秒钟， 将管壁液体（用加样器）完全移净。;11)室温干燥3－5 min （根据RNA沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，避免过分干燥,此步骤非常关键。）;12） RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 13.5 ?l，加到RNA上，进行吹打溶解RNA 沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。 13) 吸出 4.5 ?l溶液放到冰上备用　(将用于电泳). 14) 剩余 9 ?l溶液,放到冰上备用（将用于RT－PCR）.;实验二. RNA 的琼脂糖凝胶电泳; 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解; 　　　　　　　 RNA样品： 4.5 ? l 上样缓冲液： 1 ? l 　 　　 混匀后， 5.5 ? l 直接电泳上样（100伏，10－30分钟） 　　 上样前预电泳5min。; RNA电泳结果 ; 分析本次实验结果：28S、 18S和5S的比例。;实验三：逆转录反应及PCR（RT-PCR);逆转录酶： 存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC 。