PCR实用技巧 - 资料中心 - 生物在线.docVIP

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2017-06-18 发布于天津
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实用技巧一增加的特异性这是最重要的一步理想的只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件足够长以保证特异性当然不是说越长越好太长的引物同样会降低特异性并且降低产量端和中间序列要多以增加稳定性避免端最后个不要有或者最后个有个不要是避免端的互补否则容易造成避免端的错配避免内部形成二级结构附加序列加到端在算值时不算但在检测互补和二级结构是要加上它们使用兼并引物时要参考密码子使用表注意生物的偏好性不要在端使用兼并引物并使用较高的引物浓度最好学会使用一种引物的另一个重要参数是熔解温

PCR实用技巧一、增加PCR的特异性： 1. primers design 这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件 a. 足够长18-24bp，以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量 b. GC% 40%~60% c. 5 端和中间序列要多GC, 以增加稳定性 d. 避免3 端GC rich, 最后3个BASE不要有GC, 或者最后5个有3个不要是GC e. 避免3 端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3 端的错配 g. 避免内部形成二级结构 h. 附加序列(RT site,