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酶工程原理及应用 第三章 酶的分离提取及纯化制备 一、分离技术的基本原理及策略 二、常用的提取技术原理及应用 三、常用的分离纯化技术原理及应用 四、酶的制剂化技术 一、分离技术的基本原理及策略 分离技术的基本原理 主要是依据离心力、分子大小（筛分）、浓度差、压力差、电荷效应、吸附作用、静电作用、亲和作用、疏水作用、溶解度、平衡分离等原理对原料或产物进行分离、纯化。不同的分离对象需要采用不同的分离方法才能有效地被分离。 生物分离的基本过程 生物分离工艺流程： 一般包括原料的选取、预处理、细胞破碎、固-液分离、初步纯化（分离）、精制（高度纯化）和成品加工等过程。 生物分离的各阶段的常用方法 发酵液的预处理 加热 、调pH、絮凝和凝聚。 固液分离 沉降、离心分离、过滤、错流过滤。 细胞破碎 机械法：高压匀浆、高速珠磨、超声波破碎； 非机械法：化学法、酶解法、渗透压冲击法、冻结融化法、干燥法。 初步纯化 沉淀法、吸附法、萃取法、超滤法 高度纯化 吸附层析、亲和层析、凝胶层析、离子交换层析、电泳、结晶和重结晶。 成品加工 无菌过滤、去热原、干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、制剂。 生物分离技术的特点 1、需要对目标产物的快速分离纯化 2、需要对原料液进行高度浓缩 3、需要借助新型的分离技术和材料 4、需要除去有害人类健康的物质 5、采用利于保持目标产物产品质量的操作条件 6、产品要求高质量、高纯度 因此，生物分离过程往往成本很高，在某些产品的生产过程中，分离成本可能占到总成本的80％以上。 分离纯化方法选择的基本原则 尽可能简单、低耗、高效、快速。 分离步骤尽可能少，每步收率尽可能高。（1）分离步骤越多，回收率越低；如Y10 = 0.9510 = 0.63，Y5 = 0.955 =0.77；（2）分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长 避免相同原理的分离技术多次重复出现，分子筛和超滤技术按分子量大小分离，重复应用两次以上，意义就不大了。 尽量减少新化合物进入待分离的溶液：引起新的化学污染；或蛋白质的变性失活 合理的分离步骤次序。原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。 设计分离纯化工艺的基本要求 分离效率的评价 浓缩率（富积率，concentration factor） 原料(Raw material) 分离器 产品(Product) FW VW cT,W cX,W    废液(Waste fluid) 意义：1）如mT 1，则目标产物得到富积；2）如mT = mX，则目标产物未得到分离纯化。 分离因子(separative factor)， 或分离系数(separative coefficient) 意义：A、目标产物浓度，杂质浓度，则分离因子大，分离效率； B、 = 1时，则未分离。故在分离为主要目的时,   回收率(recovery)： 纯化因子(purification factor) 对于具有生物活性的蛋白质或酶，常常用分离前后目标产物的比活 A [in U/mg]之比表示目标产物的分离纯化程度， 生物分离方法的选择 对于一个未知化学结构和性质的组分的分离制备设计，大致可按以下六个基本步骤进行： 1、查找与待分离组分相关的基础性研究资料，建立相应的分析鉴定方法； 2、开展制备物的理化性质稳定性的预备试验； 3、开展材料处理及抽提方法的选择试验； 4、进行分离纯化方法、程序的摸索及其分离效果的评价； 5、进行产物均一性的测定； 6、进行中间试验和工业生产应用的放大设计，确定最佳的分离方法。 成品规格（或产品质量标准） 五肽胃泌素的上海市药品标准（1993年版32页） 指标名称 指标 含量（C37H49N7O9S） 97.0-103.0 比旋光度 -25˚ ~ -29˚ 吸收值比 A(280nm):A(288nm) = 1.12-1.22 氨基酸 各氨基酸之比为1 干燥失重，% 0.5  进料的组成和物性