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大景深显微镜原理及其应用 （哈尔滨工业大学土木学院，黑龙江哈尔滨150001）摘要：本文论述了大景深显微镜原理，相关的理论基础，以及增大景深的经典方法，最后论述了大景深显微镜的应用。关键词：大景深增大景深缩小孔径引言增大光学成像系统的景深一直以来都是应用光学领域的研究热点。自上世纪60 年代由 Welford 提出环形孔径增大景深方法以来，又出现了很多其他的方法。比如幅度切砋法，二维图像序列的图像融合，特殊设计透镜结合图像处理，加载相位模板的普通镜头结合图像处理（波前编码），三维数字全息等等。大景深光学成像系统可以应用于很多领域，比如生物或医学样品的三维显微成像、机器视觉、红外成像、空间光学成像、手机摄像头、数码相机等等。大景深的概念景深是指在固定像平面上成清晰像时对应的物方深度范围，也就是说在保证得到清晰像时物体能够在物方空间前后移动的最大距离。通常的光学成像系统的景深范围是有限的，当通过某种方法使得成像系统的景深增大后，就称此时的成像系统是大景深成像系统，此系统具有大景深特性。2大景深光学成像系统的理论基础大景深光学成像系统理论是基于标量衍射理论。大景深光学成像系统是在普通光学成像系统的光瞳处增加特殊设计的相位模板并结合后续的图像复原来实现的。标量衍射理论是指用一个光源照明不透明屏幕上的一个孔径时，在屏幕后一定距离的平面上观察光强的分布，会发现边界处的光强是从明到暗的渐变过渡，而非微粒学说所预言的突变。如果采用质量更好的光源，会看到明暗条纹的存在一直扩展到屏幕的几何阴影区内很远的地方。这就是衍射现象。索末菲把衍射定义为“不能用反射或折射来解释的光线对直线光路的任何偏离”。解释衍射现象的理论经历了四个历史阶段，首先是 1678 年惠更斯（波动学的最早倡议者）给出了一个直观信念：把光扰动的波前上的每一个点都看成是一个“次级”球面扰动的新波源，那么随后任一时刻的波前可以由这些次级子波的包络得到；接着，1818 年菲涅耳对惠更斯的直观信念进行了很大改进，用杨氏干涉理论补充了惠更斯的包络作图法。通过对惠更斯的次级波源的有效振幅和位相做一些任意的假定，并且让各个子波相互干涉，以极高的精度计算出衍射图样中的光场分布；随后，1882 年基尔霍夫通过两个关于投射到放在光的传播路径上的障碍物的表面上的光的边值条件假定，建立了坚实的数学基础，证明出菲涅耳的想法是光的波动本性的逻辑结论；1894 年索末非发现了菲涅耳理论中两个假定的自相矛盾，得到了瑞利-索末菲衍射理论。基尔霍夫理论和瑞利-索末菲理论都是做了某些主要的简化和近似的，尤其是把光作为标量现象来进行处理，也即是只考虑电场或磁场的一个横分量的标量振幅，而假定任何别的有关的分量可以用相同的方式独立处理。这忽略了一个事实：电场矢量和磁场矢量的各个分量是通过 Maxwell 方程组耦合起来的，并不能相互独立处理。不过实验表明，标量理论在满足以下两个条件时能够得出非常准确的结果：1）衍射孔径必须比波长大得多；2）不要在太靠近孔径的地方观察衍射场。2.1大景深光学成像系统模型原理图采取增大景深的方法，即在普通光学成像系统的光瞳或者孔径光阑处放置一块特殊设计的相位模板来对成像波前进行调制，使得光学成像系统的光学传递函数体现出离焦不变性，接着对CCD等成像器件得到的数字图像进行图像复原操作，从而得到大景深的较清晰图像，原理方框图如图1所示。而且大景深光学成像系统的光路图如图2，其中CCD成像芯片所在像面的像距为di，CCD的共轭物距为do，da为物方轴上某点所对应的物距。这里的do，da和di没有考虑符号问题。规定离焦量δz＝do-da。δz0 表示物点所对应物距要比CCD的共轭物距大，在此我们称之为远离焦。类似地，把δz0称之为近离焦。图1 大景深光学成像系统原理框图图2 大景深光学成像系统的成像光路示意图3经典的增大景深的方法——缩小孔径对于普通光学成像系统而言，最方便的增大景深的方法就是缩小孔径光阑的通光口径。但是随着孔径的缩小，输出的成像光能量急剧衰减，并且系统的截止频率也会随之下降，从而导致成像质量下降。图4所示的为普通的圆形孔径对应的成像系统在缩小孔径过程中不同离焦条件下所对应的点扩散函数PSF以及幅度调制函数MTF的变化曲线以及MTF密度图。图中的W20是离焦参量，单位为波长λ。W20为0代表系统良好聚焦。其中的点扩散函数 PSF 曲线均以全口径（系统孔径光阑直径最大时）良好聚焦时中心光强作为归一化因子，此外对系统的 MTF 的空间频率进行了归一化处理。从点扩散函数可以看出，当孔径变为最大时的0.75 时，良好聚焦位置对应的中心光强变为原来的0.32；孔径变为原来一半时，对焦面中心光强已经变为0.06。并且，随着孔径的缩小，弥散斑的尺寸也在不断增大。从 MTF 曲线可以看到，随着