第一章 RNA病毒“拯救’’技术.pdfVIP

中 国 生 物 工 程 杂 志 第 23卷第 9期 2003年 9月 RNA病毒 “拯救’’技术 刘玉良 刘秀梵 (扬州大学 畜禽传染病学农业部重点开放实验室 扬州 225o09) 摘要 介绍 了RNA病毒拯救技术体系建立的简要过程 、拯救成功与否 的主要影响 因素 以及优化 拯救体 系的主要研究进展 。着重介绍 了该技术在分子病毒学研究和疾病防制 中的重要应用及发 展前景 。 关键词 RNA病毒 反向遗传 拯救 近年来 ，在分子病毒学研究领域兴起一 门新型 基 因组全长片段 的克隆是病毒拯救技术 的关 技术 ，即病毒 的全长感染性 cDNA克 隆技术 ，是一 键环节 ，大多数研究者均采取 “分段克隆”的策略 ， 种反 向遗传操作技术 (reversegenetics)，通常被称为 将病毒基 因组各片段顺次克隆到复制严谨性较高 “病毒拯救 (therescueofvires)”，它解决 了 RNA病 的低拷 贝载体上 。在构建 cDNA克隆时，一般均在 毒基 因组难 以操作这一 困扰研 究者 多年 的难题 。 一 处或几处合适 的位置上进行沉默突变 ，这样便于 从 cDNA克隆拯救 出负链 RNA全病毒是 90年代分 鉴定拯救 的病毒 。基 因组 3末端和 5末端 的克隆 ， 子病毒学研究领域最振奋人心的突破之一 ，它开启 大多采用 cDNA末端快速扩增法 (RACE)，其 克 隆 了对病毒基 因组进 行人工操作和详细 了解病毒基 的准确性会直接影 响拯救效率 。为产生准确 的3 因及其产物功能的大门。该技术发展迅速 ，倍受国 端 ，一个重要 突破是发展了带有 自我剪切功 能 的核 内外研究者关注u 。 酶序列 的载体 ，这样转 录出的 RNA具有准确 的 3 与经典 的从表型改变 到进行基 因特征研 究 的 端 。3端几个到几百个碱基 的非病毒序列常使病 思路相反 ，病毒拯救技术是指通过构建 RNA病毒 毒转录本 的生物活性 降低甚至丧失 ，但一些病毒在 的感染性分子克 隆 ，在病毒 cDNA分子水平上对其 3端有大于 30个核苷酸 的额外序列而其转录本仍 进行体 外人工操作 ，如进 行基 因点突变 、缺失 、插 有感染性 。很多研究者均发现 ，5端转录本序列 的 入、颠换 、转位和互补等改造 ，以此来研究 RNA病 正确与否对病毒 复制的影 响 比 3端更重要 。5端 毒的基 因复制与表达调控机理 、RNA编辑和 自发 冗余 的核苷酸常使拯救 出的病毒 的感染性降低甚 重组与诱导重组 、病毒与宿主间的相互作用关系、 至消失 ，这在植物病毒上尤为 明显 。有趣 的是 ，在 抗病毒策略、基 因治疗研究 以及构建新型病毒载体 大多数动物病毒上这种影 响相对较 小。而且 ，很 多 来表达外源基 因和进行疫苗 的研制等 。 研究均发现 ，5端少量多余 的核苷酸 (一般为 1—3 个 G碱基)为 T7RNA聚合酶适宜 的起始序列 ，会 1 病毒拯救技术的建立 促进转录 ，提高拯救效率 。在宿主细胞核酸酶 的参 建立病毒拯救技术体系主要包括基 因组全长 与下 ，额外 的碱基会在复制 中消失 。因此 ，5端和 片段 的 cDNA克 隆及 改造 、辅助质粒 的构建 、序 列 3端非病毒序列对拯救 的影 响尚难 以定论。 测定、共转染拯救病毒粒子和新生病毒有关特性 的 虽然通常认