第九章 高效毛细管电泳.pptVIP

三、HPCE中影响电渗流的因素 3. 电解质溶液性质的影响 4. 温度的影响 5. 添加剂的影响 0.92 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 3.5 十四烷基三甲基溴化铵（TTAB） 15 十二烷基三甲基溴化铵（DTAB） 16 十二烷基三甲基氯化铵（DTAC） 阳离子表面活性剂 5.7 N-十二酰基-L-氨酸钠（SDVal） 两性离子表面活性剂 2.8 聚氧乙烯醚基十二烷基硫酸钠 8.7 N-月桂酰-N-甲基牛磺酸钠（LMT） 2.1 十四烷基硫酸钠（STS） 8.1 十二烷基硫酸钠（SDS） 阴离子表面活性剂 CMC（10-3mol/L） 表面活性剂 类 型 一些常用的表面活性剂及其临界浓度 三、毛细管凝胶电泳（CGE） 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成一个细长的网状多孔凝胶，其具有多孔性，类似分子筛的作用。电荷/质量比相等但大小不同的分子，在电场力的作用下发生迁移，其运动速度受到凝胶网状结构的阻碍。大分子受到的阻力大，移动速度慢，小分子受到的阻力小，移动速度快，从而使它们得以分离。 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，在CZE模式中，淌度几乎没有差别，很难分离，采用CGE能获得良好分离，是研究DAN排序的重要手段。 酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离 四、毛细管电色谱（CEC） 将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁键合固定相，毛细管两端施加高电压，以电渗流驱动操作缓冲液。它也包含了电泳和色谱两种机制，溶质根据它们在流动相和固定相中的分配系数不同和自身淌度的差异得以分离。 电渗泵产生的是塞子式流动轮廓，而不是流体动力学层流轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比高效液相色谱法高。 目前反相毛细管电色谱研究应用最多。 四、柱效和分离度 （一）理论塔板数和塔板高度 用理论塔板数n和塔板高度H表示柱效。n可以直接由电泳图求出 tm为起点到谱峰最高点所对应的时间，称为迁移时间。因为毛细管中，没有固定相，不存在组分在固定相中分配和保留。 塔板高度H为： Lef为进样口到检测器的距离, 为有效柱长.检测器在柱上，LefL （二）谱带展宽 在理想的情况下，纵向扩散是HPCE中导致谱带展宽的唯一因素。根据范第母特方程 1. 纵向扩散 D是溶质组分的扩散系数 V是电压，L是毛细管全长。 纵向扩散与扩散系数成正比，与表观电泳速度成反比。Vap小，tm长，谱峰展宽。 若只考虑纵向扩散，则理论塔板数为 由上式可知，n与电场强度E（或电压V）成正比，与溶质的扩散系数成反比。 大分子比小分子扩散系数小，可以获得更高的分离效率。 在HPCE中，溶质在几万至十几万伏的电压下，迁移速度较快，纵向扩散小，柱效高。 在实际电泳过程中，出了溶质的纵向扩散外，还存在很多引起谱峰展宽的因素，如焦耳热、吸附等。 2. 焦耳热 电流通过毛细管内缓冲溶液时产生自热，称焦耳热。焦耳热通过管壁向周围环境散热，管中心温度最高，由中心向管壁温度逐渐下降。温度高粘度小，因而管中心的迁移速度最快，管壁附近的迁移速度最慢，破坏了溶质带的扁平流轮廓，导致溶质区带展宽。 小内径毛细管散热面积大，温度梯度小，谱峰展宽小。但是，内径过细会带来检测、进样等方面的一系列困难，又易造成柱的堵塞。因此目前采用的多是内径25～75μm柱子。 采用低淌度缓冲液，如Tris [三-（羟基甲基）氨基甲烷]等。这种粒子的质荷比很大，可以减小工作电流。 采用温度控制装置，尽快除去热量，使系统尽可能地保持恒温，是目前常采用的办法。冷却温控的方法有两种，气冷和液冷，一般条件下，用气冷已可以满足要求。 3. 吸附 毛细管内壁对靠近内壁的溶质粒子的吸附，使迁移速度减慢，导致谱峰变宽。造成管内壁表面吸附的主要原因有两个: ①在电解质溶液PH大于3时，石英毛细管壁带负电荷，因静电引力溶质阳离子被管壁吸附。 ②蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，有较强的疏水作用，被极性水溶剂向管壁挤压，在PH小于3，管壁呈电中性时尤为明显。 抑制或消除吸附的常用方法有： （1）采用极端pH条件。即在低pH（2～3）或高pH（＞9）的缓冲液中进行CE分离，这样可以抑制管壁硅醇基的离解或使被分析物质带负电，与管壁相斥，吸附受到抑制。 （2）对管壁内表面加以修饰 （三）分离度 毛细管中的分离度也用R表示，可按谱图直接由下式计算： 分离度也可表示为柱效的函数： 影响分离度的主要因素 ①工作电压V；②毛细管有效长度与总长度比； ③相邻两组分的有效电泳淌度差；④表观淌度。 第三节 毛细管电泳仪 毛细管电泳仪结构比高效液相色谱仪 简单。CE只需高压直流电源、进样装