microRNA PCR实验数据分析.PDF

microRNA PCR实验数据分析 Genetimes Tech Inc 张再超 Email: zhangzaichao@ Presentation Agenda 1. microRNA qPCR技术基础理论 2. microRNA qPCR定量分类 3. miRNA qPCR技术熔解曲线分析 2 实时荧光定量PCR原理？ 实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中引入 荧光基团，利用荧光信号的变化实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线和CT值对未知模 板进行定量分析的方法。是一种指数增长期定 量的方法。 2012-05-07 3 荧光定量PCR的化学基础 DNA binding SYBR Green I™, EvaGreen, LCGreen, SYTO9 Probe based TaqMan® detection Molecular Beacons (dual-labeled probes) And others… Taq Taq 荧光定量PCR的化学基础 DNA结合染料 SYBR Green Ⅰ、SYBR Green Ⅱ、SYTO9、HRM等。共同性质为： 1、结合于双链核酸的小沟处 2、与双链DNA结合后受激产生荧光，在变性条件下双链分开， 荧光消失 荧光定量PCR的化学基础 Taqman探针类 5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，探针完整时，没 有荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧 光； 探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针 与目的基因互补序列结合，随着PCR反应的进行，在Taq酶 5’3’外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。 TaqMan反应过程－退火 3’ 5’ 5’ 3’ 模板和探针及引物杂交 2012-05-07 7 TaqMan反应过程－延伸 Forward R Primer Q 3’ 5’ 5’ 3’ Reverse