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细胞电转染 电转的简介 1 电穿孔转染的基本原理及过程 1 电穿孔转染条件的选择 1 1 电参数1 2 脉冲时程2 3 脉冲次数2 4 细胞因素3 5 质粒因素3 6 温度4 7 ．缓冲液以及培养液的成4 仪器常用键区介绍 5 TM Neon 电转染一般流程 7 电转的简介 电穿孔转染，作为物理方法的一种，出现于20 世纪80 年代中。这种方法不仅能 够将DNA 、RNA ，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物 细胞和植物细胞。它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其它转移方法无可 比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，臻染率高，适用谱广等。尤其 对目前一般认为难转染的悬浮培养细胞也能获得较高的转染。 电穿孔转染的基本原理及过程 电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔 或开口，把大分子如DNA 等导入细胞并最终进入胞核的技术。其过程简述如下： 首先在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触， 并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。再次电击后，质粒脱离复 合物并扩散至胞质内，开始瞬转；同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始 稳转。一旦DNA 扩散进入细胞，细胞膜上的小孔可 自动重新闭合。 电穿孔转染条件的选择 1 电参数 电场强度E 与电压V 有以下关系：V=E×d，在电穿孔实验中，d 为两电极之间的 距离，是一个定值，故本文所指的电场强度的选择即电压的选择。对于动物细胞 来说，电场强度通常选择1～1000V ／cm，并遵循低电场长时程的原则。电场强 度的大小对DNA 摄入量的影响主要有：在阈电场强度Ec (Ec=Uc ／1．5R) 以下 无R) 以下无DNA 摄入；适中的场强下DNA 的摄入呈电场依赖型，随场强的升 高而增大；高场强下，DNA 的摄入进入平台期，与电场的大小无关。电场强度 的大小对细胞存活率的影响主要有：在阈电场强度以下存活率无变化；在适中的 场强下，存活率呈电场依赖型，随场强的升高而下降；存活率在高场强下降为0 。 因此，要保证较高的转染效率，必须综合考虑DNA 摄入量以及存活率两个方面。 不同的细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方式除了实验直接测定比较不同场 强下(对悬浮细胞来说，取 1～3 倍的阈电场强度，对贴壁细胞来说可升至 5 倍) 转染率的高低之外，还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在 50 ％左 右的电场参数为较理想的参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。 2 脉冲时程 时间常数为电容与电阻的乘积，是设定的电压呈指数衰减到 37 ％的时间。电脉 冲的时间长短对 电转染效率有较大的影响，太长、太短都会使转染效 率下降。 最佳时间的确定主要取决于细胞的大小， 细胞越大，穿透胞膜所需的脉冲时程 越长。电转染 真核细胞的脉冲时程一般控制在ms 级(不小于1 ms) 。电脉冲之前， DNA 和细胞随机分布于电极之 间；电脉冲早期，DNA 和细胞向阳极运动；电 脉冲后期 DNA 分子撞向细胞阴极面或末端，并且插入细 胞外膜或者进一步进 入细胞膜间隙，随后在孵育期间，DNA 通过内膜渗透进入胞质。因此电压脉冲 有双重效应，即驱使 DNA 快速向阳极运动以及向受 体细胞表面渗透。电脉冲 的时间太短，则不能使 DNA 分子有效进入细胞；而电脉冲时间过长，细 胞局 部过热可导致不可恢复的损伤，同时电泳所引 起的细胞内外的物质进出(如Na+ ／K+浓度差的破 坏)都可引起细胞存活率下降，转染效率的提高被抵 消。真核 细胞基因转染一般遵循低电场长时程的原 则。长时程(一般20～60 ms)可使细胞 上的穿孔更 大，开放时间更长。此外，适当地延长时程也能降低 电穿孔的阈电 场值，加大电场依赖性吸收的斜率，提 高平台期电场值的放大作用。 3 脉冲次数 脉冲次数的选择一般为 1～10 次，实验证明对 于大多数细胞系较理想的脉冲次 数为3～4 次。第1 次脉冲后，外加的电场开始在细胞膜上穿孔，第2 次脉冲后， DNA 在电泳力以及细胞膜蛋白运输的共同作用下转入细胞，当然脉冲也同样触 发电渗透、扩散、内吞等运输方式。理论上，2 次脉冲足以使 DNA 转入绝大多 数细胞，再增加脉冲次数，虽仍有 助于提高转染效率，但如果次数多于5 次， 导致细胞 损伤直至死亡的负面效应便