分子生物技术-培训课件.pptxVIP

分子生物技术在生理学中的应用;细胞复苏和传代的基本过程;4、待细胞长至致密单层时移去培养基，用PBS清洗细胞2次，加入37℃预热的0.25% 胰蛋白酶2mL消化3min左右。显微镜下观察到细胞逐渐变圆但尚未离壁时，吸走胰酶。 5、加入约2mL DMEM完全培养基吹打使细胞悬浮，室温下1100rpm离心5min，弃上清。细胞沉淀中加入DMEM完全培养基，按5×105个细胞/mL的密度接种于培养瓶中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。 ;细胞划痕实验的基本过程;transwell实验的基本过程; 采用TRIzol试剂（Invitrogen）提取细胞总RNA，取1.0g RNA样品，采用SuperScript First-Strand Synthesis kit (Invitrogen) 试剂盒合成cDNA。采用SYBR Green PCR master mix试剂和ABI 7500 Fast Real-Time PCR System仪器进行定量PCR检测。采用ΔCt值的方法对各个样品中基因表达水平进行相对定量。引物由上海捷瑞公司合成。 ;（1）提取总RNA ① 细胞分组处理后，每孔加入1ml Trizol，混匀，使细胞充分裂解后，移入1.5ml 无RNase离心管中，室温静置3-5min； ② 加200μl氯仿，充分混匀，室温静置2 min； ③ 将离心管于4℃，12000g，离心20min； ④ 用移液器小心吸出上层液相，放入另一离心管中； ⑤ 加入与所移出上层液相相同体积的异丙醇，以促进RNA沉淀，轻轻混匀，室温静置10min； ⑥ 4℃，12000g，离心10min，弃上清； ⑦ 在沉淀中加入1ml 75 %乙醇（DEPC水现配），轻轻洗涤沉淀； ⑧ 4℃，12000g，离心5min，弃上清； ⑨ 重复步骤⑦⑧； ⑩ 稍微晾干沉淀，约10min，在RNA略显透明时，加入50~100μl DEPC水溶解RNA，4℃静置过夜使沉淀充分溶解，-70℃保存。;（2）定量和检测总RNA ① 紫外分光光度计检测RNA的产量，用98μl DEPC水调零后，加2μl RNA样品，在260nm处的吸光度，1OD=40μg/ml； ② 根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0（比值最好在1.9-2.1之间）。 ;（3）RT-PCR ① 取1μg总RNA进行反转录，37℃，1h，合成cDNA； ② 引物分别为：VEGF 5-ACCAAGGCCAGCACATAGG-3 (sense) 和 5-ACGCTCCAGGACTTATACCG-3 (antisense)；内参为18S rRNA 5-ACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3 (sense) 和 5-CTGACCGGGTTGGTTTTGAT-3 (antisense)； ③ 根据样品数目依说明书混合PCR反应体系，分至每个PCR小管，每管加入1μl cDNA产物，PCR条件按说明书，共40次循环； ;④ PCR产物的鉴定 A. 0.6g琼脂糖加入1×TAE 50ml，微波炉加热至琼脂糖溶解，稍微冷却后加入GoldView染料2.5μl，混匀，铺板凝固后使用； B. 电泳槽中注入1×TAE溶液至高于凝胶面，PCR产物加相应体积的6×加样缓冲液，混匀上样，用DNA 标准品作为参照，110V电泳20min； C. 紫外灯下观察电泳结果并拍照保存。 ;① 全蛋白提取 细胞分组处理后，用预冷的PBS清洗细胞2次后吸干残留的PBS； 加预冷全蛋白提取缓冲液0.5ml，冰上振荡裂解细胞15min； 细胞刮刀刮取细胞，上下吹打细胞数次，使其悬浮，吸取细胞裂解悬液转移至预冷的1.5ml EP管中，冰上振荡15min； 4℃离心（12,000rpm，20min）； 将上清转入预冷的1.5ml EP管，-70℃保存备用； BCA法测定蛋白浓度。;② 免疫印迹 将蛋白样品与加样缓冲液混合，100℃加热5 min，离心3 min，取上清加样后进行蛋白电泳； 电泳条件为初始电压80 V（30 min），待样品进入分离胶后，电压增至110 V，直至电泳结束； 电泳结束后，用硝酸纤维素膜进行转膜。转膜电流1.2 mA/cm2胶面积，250mA恒流湿转2h； 转膜完成后，用立春红染液染色观察转膜效果，TBST洗去立春红（此步染色可省略）； 纤维膜与5 %封闭液室温孵育1h； TBST缓冲液洗膜5 min×3次； 加一抗，杂交袋内平缓摇动，4℃过夜； 回收一抗，TBST缓冲液洗膜5 min×3次； 加相应二抗，杂交袋内平缓摇动，室温1 h； 弃液体，TBST缓冲液洗膜5 min×2次，TBS缓冲液洗膜1次； 加发光底物ECL，凝