第十一章 gateway技术.doc

Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间同时将您的基因转移到多个表达系统在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。图1 Gateway技术的灵活性 下载 (41.22 KB) 6?天前?19:23 Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。二、一项强大而可靠的技术Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。 LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。表1 反应和术语总结 反应 反应位点 产物 产物结构 BP反应 attB×attP 入门克隆 attL1-基因-attL2 LR反应 attL×attR 表达克隆 attB1-基因-attB2 图2 Gateway技术总结 下载 (22.19 KB) 6?天前?19:23 Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。完成构建Gateway表达克隆仅需两步（图2）：（1）创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。（2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。）有几种方法可以构建Gateway入门克隆。无论您选择何种方法，创建的入门克隆都是准备用来与各种目的载体进行重组。（1）PCR克隆（定向TOPO克隆至入门载体或与供载体B×P重组）（2）限制性内切酶消化和连接进入入门载体（3）使用pCMV?SPORT6或pEXP-AD502*构建Gateway兼容cDNA文库（4）Gateway改造过的克隆资源** 这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。这些克隆可以通过与供载体及BP Gateway酶反应转换到入门载体。获得已有克隆资源的更多信息。三、PCR定向（PCR-Directional）TOPO克隆定向TOPO克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。进行5分钟的简单连接，产生90%的重组子。您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获得克隆，而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。定向TOPO克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。平端PCR产物定向克隆的效率90%，从而简化了筛选。同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或者限制性内切酶。目前有两种定向TOPO克隆载体。pENTR/D-TOPO 和pENTR/SD/ D-TOPO（表2和图3）有以下特点：位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway目的载体进行有效重组通用M13位点便于测序基于pUC的ori位点提供高产量质粒大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因筛选表2 两种pENTR/D-TOPO载体的简单比较 入门载体 特点 优点 pENTR/D-TOPO 无SD（Shine-Dalgarno）位点 真核细胞中天然、N-或C-端