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基因工程药物设计 目的基因的获得 反转录法 1、mRNA的纯化： 真核细胞mRNA 3’ 端有一多聚腺苷酸-polyA，用亲和层析法mRNA从细胞中分离出来 2、cDNA的第一链合成： mRNA 3、cDNA第二链合成： 用碱解或RNaseH酶解法除去cDNA-mRNA中的mRNA,再以cDNA为摸板合成第二链，再用核酸酶SⅠ酶切除单链DNA。 4、cDNA克隆： 克隆载体有：质粒DNA、噬菌体DNA 载体转导或转化宿主细胞 5、cDNA文库鉴定： 根据表型进行筛选如抗性基因失活法、菌落颜色变化等 6、目的cDNA克隆的分离和鉴定： 分离方法：核酸探针杂交法： 根据目的基因蛋白质纯品aa序列分析，人工合成单链寡核苷酸 作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR) mRNA经反转录合成cDNA第一链，不需再合成cDNA第二链，而是在特殊引物协助下，利用PCR扩增，特异地合成目的cDNA链，用于克隆重组 化学合成法 较小分子蛋白质或多肽的编码基因在已知其核苷酸序列的条件下，化学合成此基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短序列，再退火成两端形成黏性末端的DNA双链片段 基因筛选 编码序列富集法 利用磁场力对cDNA文库中的目的基因进行富集；将质粒DNA库酶切后连上接头，用5’端以生物素标记的与街头序列相同的引物序列进行PCR扩增。将cDNA文库的插入片段同样扩增后，两者杂交得到带有生物素的DNA双链，溶液加入含磁珠核心的链霉抗生素蛋白，加外磁场，目的基因与其他DNA片段分离被富集 岛屿获救PCR法 直接从已测序的基因组DNA上寻找编码序列，计算机分析找出开放阅读框，外显子陷阱法或寻找CpG岛克隆编码基因 CpG岛（CpG islands）含有大量胞嘧啶C、鸟嘌呤G的DNA片段，在基因组DNA中均匀地分布着Alu序列（Alu重复序列属于SINE家族，序列中有限制性内切核酸酶Alu的识别序列AGCT）利用这两段序列，给CpG岛特有的限制酶切割后片段加上泡状接头，再用泡状引物和Alu特异性引物进行PCR扩增，电泳分离出特异片段作为探针对cDNA文库筛选 功能克隆法 利用基因敲除RNA干扰 酵母双杂交 高通量筛选 流式细胞术等从基因蛋白质表达调控等多水平获得基因功能信息 构建cDNA文库 EST提供引物信息，PCR扩增特异片段 差异显示技术的应用 mRNA差异显示 减数PCR 差减杂交等技术寻找新基因 *对已发现基因的改造 基因修饰及点突变研究基因新功能 基因表达 构建表达载体 获得目的基因后，选择合适的宿主进行表达，基因表达的微生物宿主有两类：原核细胞，以大肠杆菌，枯草杆菌，链霉菌等为主；真核细胞，有酵母和真菌等。 ?大肠杆菌体系中的基因表达 Pbv220系统 组成：来源于pUC8多克隆位点 核糖体rrnB基因终止信号 pBR322第4225～3735位 pUC18第2066～680位 λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子 pRC23的PL启动子及SD序列 pBG-2系统 pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体 在PRPL启动子下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对，下游是多克隆位点，引入剪切融合蛋白具有与IgG结合的活性，可用亲和层析简化下游工艺 pET系统 插入基因的转录和翻译系统来源于T7噬菌体。表达由位于宿主细胞染色体上的T7-RNA上宿主细胞染色体上的T7-RNA聚合酶控制，T7-RNA聚合酶启动子为lacUV5,由IPTG诱导 ?酵母体系中的基因表达 Yep类（yeast episomal plasmid 酵母附加体质粒） YRp类（yeast replication plasmid酵母复制型质粒） YCp类（yeast centromeric plasmid 酵母着丝粒质粒） YIp类（yeast integrative plasmid酵母整合型质粒） 克隆载体：向酵母载体中引入大肠杆菌质粒pBR322的ori部分和Ampr或Tetr部分，构成的载体同时带有细菌和酵母的复制原点和选择标记。 表达载体：可引入外源基因在酵母细胞内保存复制并随酵母分裂传递到子代DNA中 体外重组 DNA连接酶: 大肠杆菌DNA连接酶：二磷酸吡啶核苷酸为辅助因子 T4噬菌体DNA连接酶：ATP为辅助因子（多用） T4噬菌体DNA连接酶作用机制 黏性末端链接 设定连接温度37℃，12-15 ℃过夜 载体：外源DNA=1：3并用碱性磷酸酶处理载体防止载体自身环化 转化与感染 将外来重组分子和感受态细胞在低温下混合，使其进入受体