基因工程重点归纳.docVIP

第一章 基因工程：将在细胞外用各种方法产生的核酸分子插入病毒、细菌质粒或其他载体系统，形成遗传物质的新组合，族中整合掺入到本来不包含这些核酸分子的宿主生物中，并进行复制繁衍。 第二章 Southern Blotting：将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色 Northern Blotting：将待检测的RNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到DBM纸上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 RNA电泳 转膜 杂交 洗膜、曝光、冲片 Western Blotting：将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。 SDS电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭 一抗洗涤酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影 Blotting Southern Northern Western Sample ＤＮＡ　　　ＲＮＡ　　　　　Ｐｒｏｔｅｉｎ Hybridization　　DNA-DNA　　RNA-DNA 　　　Protein-Protein ｍolecule　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(Ag-Ab)免疫印迹 ＰＣＲ（多聚酶链式反应）　变性（90～97℃）退火（45～55℃）延伸（72℃左右） ＰＣＲ原理：ＰＣＲ涉及两个寡聚核苷酸引物，长度为１７－３０个核苷酸，位于所要扩增的ＤＮＡ序列两侧。当ＤＮＡ变性后，引物可以与其相反的链进行杂交，而且引物的方向使聚合酶可沿两引物之间的区域进行ＤＮＡ的合成反应。延伸反应产生两个双链的靶区域，它们都可以再次变性，从而进行第二轮杂交和延伸反应。第三轮产生的两个双链分子完全是双链形式的靶区域。通过热变性、引物杂交和延伸的重复循环，特异的ＤＮＡ靶片段很快就会以指数积累起来。 引物的设计原则 引物长度应该在１７－３０个核苷酸之间 ＧＣ的理想含量为５０％。对ＧＣ含量偏低的引物，最好选择较长的引物以避免变性温度偏低 应该避免具有单核苷酸长重复的序列 最好不采用有明显二级结构的引物 两引物之间不得互补 完成动物细胞的基因转移基本上可以通过３个途径。最直接的是直接ＤＮＡ转移，也就是外源DNA物理转化直接进入细胞，如显微注射。第二种方法称为转染，这包括许多化学和物理技术，这些技术可以诱导细胞从周围环境中摄取ＤＮＡ。第三种方法是用动物病毒包裹ＤＮＡ，因为病毒已进化出机制可以自然地感染细胞并将自身的核苷酸转入细胞。这种将外源ＤＮＡ转入细胞的方法称为转导。无论选择哪种方法，结果都是转化，也就是获得的外源DNA造成了受体细胞的基因型发生了变化 其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细 胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态 第三章 第二活性：在次理想条件下,一些限制性内切酶的特异型会被降低,只有部分正常识别位置被识别,此称为第二活性。酶的第二活性将引起底物DNA链上切口增多，酶解片断变小，造成特异性降低。次理想条件：通常包括不适合的离子强度、过高的PH、 二价金属离子的替换、较高的甘油浓度等。 大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：5‘→3‘的DNA聚合酶活性；5‘→3‘的核酸外切酶活性; 3‘→5‘的核酸外切酶活性 大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途：缺口前移标记法制备32P标记的探针 第四章 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 质粒克隆载体的理想特性 相对分子质量小 可以在宿主细胞中产生便于选择的表型特征 多种限制性内切酶