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QX100 用于HER2 拷贝数变异检测的评价 厦门大学分子诊断教育部工程研究中心 李庆阁教授 摘要：拷贝数变异（CNV ）是与广泛的人类疾病相关的成百上千万个碱基序列 的基因组片段的重复或缺失，很多肿瘤疾病都与CNV 有关。肿瘤的异质性可能 降低CNV 的检测能力，这就需要一种更精确的检测方法从大量的野生型背景中 区分出少量的变异。新型微滴式数字PCR，能够更准确定量更小的拷贝数变异。 本实验采用QX100 微滴式数字PCR 系统，对乳腺癌标本的HER2基因进行CNV 和表达水平的检测，结果与临床上的免疫组化和荧光原位杂交结果基本吻合。 1 前言 HER-2/neu （又称c-erbB-2 ）基因为表皮生长因子受体家族成员之一，是一 种原癌基因，主要在胚胎发育时开始表达，成年后正常组织中可检到少量的 HER-2/neu基因。研究表明，HER-2/neu基因扩增或过表达的乳腺癌患者易早期 [1] 复发且生存期缩短 ，而赫赛汀是一种针对乳腺癌HER2 靶点的靶向治疗药 [2,3] 物 ，在HER2 阳性的乳腺癌治疗中具有突出的疗效。目前临床上常用的方法 是荧光原位杂交法（FISH ）和免疫组化法（IHC ），这些方法都不能准确区分小 于2 个拷贝的拷贝数变化，而微滴数字PCR能够满足该要求。 QX100 微滴式数字PCR系统对待扩增的样品进行微滴化处理，即将含有 DNA的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴。经PCR扩增后，逐个对每个微 滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0 ，根据 泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓 度[4,5] 。 本实验对乳腺癌标本的HER2 基因的拷贝数进行检测，并与RNA水平 的检测结果进行比较，同时对比临床病理信息展开研究。 2 材料与方法 2.1 实验材料 44 份2011 年到2012 年间手术切除后的乳腺癌FFPE 标本由福建省厦门市 中山医院病理科提供。DNA 采用血液/ 细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（天根 生化科技有限公司，北京）提取，RNA 采用RNeasy FFPE Kit （Qiagen ，荷兰） 提取。实验中使用的Bio-Rad QX100 试剂与耗材包括微滴分析专用油 （1863004 ），微滴发生专用油（1863005 ），微滴发生卡和微滴发生卡密封垫 （1863006 ），ddPCR 预混液（1863010 ），一步法 RT-ddPCR 试剂盒（1863022 ）。 2.2 操作步骤 首先将含有样品DNA 或者RNA 的反应液通过QX100 微滴发生器形成油包 水的微滴，然后转移到96 孔PCR 板在ABI 2720 PCR 基因扩增仪（Life Technologies ，美国）进行两步法的PCR 扩增，扩增程序为95℃预变性 10min； 接着95℃变性30sec，60℃退火1min，40 个循环；随后98℃加热 10min。最 后再将PCR 板转移到QX100 微滴分析仪（Bio-Rad，美国）对所有孔的样品进 行荧光检测。 2.3 HER2 拷贝数的检测 HER2 基因用FAM 标记的TaqMan 探针进行检测，同时用RPP30 基因作 为参照，探针用HEX 标记，HER2 拷贝数为HER2 基因的浓度与RPP30 基因 的浓度之比。在考察有效区分浓度微小差异的实验中，我们在固定RPP30 质粒 拷贝数的同时，对HER2 质粒的拷贝数进行1.5 倍梯度稀释。此外，我们还对 44 份乳腺癌FFPE 标本的DNA 进行检测，并将结果与临床结果进行比较。 2.4 HER2 表达水平的检测 HER2 表达水平的检测与计算方法和拷贝数的检测与计算方法相同。在该实 验中，我们将一份标本进行2 倍梯度稀释，用以考察该体系定量的准确性。此外， 我们对34 份乳腺癌FFPE 标本的RNA 进行检测，并将结果与拷贝数和临床结 果进行比较。 3 结果与讨论 3.1 HER2 拷贝数的检测 固定RPP30 质粒的拷贝数，对HER2 质粒的拷贝数进行1.5 倍梯度稀释（如 图1 ），结果证实该体系能够区分小于2 倍的拷贝数的变化，并且与实际拷贝数 相符，说明该体系能够进行准确定量。 该体系还检测了44 份乳腺癌FFPE 标本，典型的标本如图2 所示。我们对 该结果与临床上的IHC 和FISH 结果进