细胞生理2008-6课件.pptVIP

第三章 细胞生物学研究方法 ?细胞形态结构的观察方法 ?细胞组分的分析方法 ?细胞培养、细胞工程与显微操作技术 ?用于细胞生物学研究的模式生物 第一节 细胞形态结构的观察方法 ?光学显微镜技术（ Light microscopy ） ?电子显微镜技术 ( Electro microscopy ) ?扫描遂道显微镜 (Scanning tunnel microscope ， STM) 一、Light microscopy ?普通复式光学显微镜技术 ?荧光显微镜技术 （Fluorescence Microscopy） ?暗视野显微镜技术 ?激光共焦扫描显微镜技术 （Laser Confocal Microscopy） ?紫外线显微镜技术 ?相差显微镜 （phase-contrast microscope） ?微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC） ?录像增差显微镜技术 （video-enhance microscopy） （一）普通复式光学显微镜技术 石蜡切片的基本流程 材料固定(F.A.A固定液) →逐级脱水(不同浓度的酒精) →二甲苯透明→透蜡→纯蜡包埋→材料修块→切片→二甲苯脱蜡→染色→逐级脱水(不同浓度的酒精) →封片→永久切片 影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率 , 分辨率 是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力, 分辨率的大小决定于光波的波长和镜口率, 通常是用相邻两点间的距离来表示. 光学显微镜的分辨率( D=0.61λ/N．A．) 几种介质的折射率 介质折射率越接近镜头玻璃的（1.7）越好。油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5，如用α溴萘,镜口率可达1.6，根据计算, 显微镜最小数值不会小于0.2μm, 即分辨率约为0.2μm (人眼的分辨力为0.2mm)，因此显微镜的最大有效倍数为1000~1500。 0.2μm这一数值是光学显微镜分辨率的极限. 限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长(光的衍射效应), 光学显微镜无论制作得如何精密, 都无法突破是一极限. 紫外显微镜 原理: 光源光波越短,显微镜的分辨本领越大. 波长介于400nm与X射线之间的辐射称为紫外线或紫外光. 特点: 紫外线为光源, 分辨率可提高一倍, 用特殊材料(如石英等)制成的光学玻璃来制作显微镜透镜.常配有照相装置. 用途: 观察胶体颗粒,测定细胞核中有核酸含量. 不足: 价格比较昂贵,使用受限. （二）荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 荧光显微镜特点： 光源为短波光；有两个特殊的滤光片(激发光滤片和阻断滤片)；照明方式通常为落射式。 激发光滤片: 光源和样品之间, 只让能激发荧光染料发光的特定波长的光通过. 阻断滤片: 物镜和目镜之间, 只让染料所发出的荧光通过. 荧光显微镜可以观察细胞内天然物质(自发荧光)或经短波光照射后发出荧光的物质(诱发荧光)， 如叶绿体中的叶绿素能发出血红色荧光。也可观察诱发荧光物质，如用丫啶橙染色后，细胞中RNA发红色荧光，DNA发出绿色荧光，根据发光部位，可以定位研究某些物质在细胞内的变化情况。 应用： ?直接荧光标记技术 ?间接免疫荧光标记技术 ?在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用。 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 暗视野显微镜 使照明光线不直接进入物镜。只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的。 利用这种显微镜能见到小至的质点,分辨率比普通显微镜高了40倍,有些细胞器,如核、线粒体,均清晰可见。 （三）激光扫描共焦显微镜技术（LSCM）（Laser Scanning Confocal Microscopy） 原理： 激光共聚焦扫描显微镜光路图 特点： 在某一瞬间只用很小一束光照明,这一束光通过检测器前的一个小孔后只让来自该焦平面的光成像. 物镜和聚光镜同时聚焦到同一点.即它们互相共焦点. 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨率是普通光学显微镜的3倍, 是荧光显微镜的1.4-1.7倍。像异常清晰. 用途类似荧光显微镜，样品一般须经免疫荧光标记, 但能扫描不同层次，形成立体图像。 应用： 由于它能排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率，可重构样品的三维结构。在亚细胞结构与组分的定位及动态变化等的研究中应用广泛. LCSM Image