8反相层析.pptVIP

江南大学医药学院 反相层析 概述 原理 反相层析介质 反相层析的流动相 层析技术 应用 1 概述 反相层析法的建立追述到1950年，Howard和Martin用正辛烷作为固定相，水作为流动相进行石蜡油的液-液层析分离，并且把这种方法命名为反相层析 所谓“正相”或“反相”，主要是指固定相和流动相的相对极性大小，反相层析因与传统分配层析刚好相反而得名，其固定相非极性强而流动相极性相对较高，样品中组分被洗脱的顺序是极性较高的组分先流出，极性较低的后被洗脱 反相层析流动相的溶剂洗脱强度变化范围大，使溶质保留值的差别可以达到1-2个数量级，因此反相层析可分离的溶质范围很宽，从极性较大的寡肽、小分子有机物到疏水性较强的生物大分子 反相层析能够区分分子在疏水性质方面的细微差异而有效地进行分离，具备高分辨率的特性 2 原理 2.1 反相层析作用原理 疏溶剂理论（solvophobic theory） 反相层析机理普遍被接受的是Horvath于1976年提出的疏溶剂理论，假设反相层析介质是表面均匀密集的覆盖着非极性配基的颗粒，溶质分子由于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合至固定相的非极性配基上，除此之外溶质与固定相之间不存在其他任何相互作用 亲硅醇基效应（silanophilic interaction） 一定条件下硅胶表面残余的硅醇基能与溶质发生相互作用，包括：静电作用和氢键作用，从而对溶质的保留行为起决定作用; 亲硅醇基效应常导致溶质保留值重复性差，洗脱峰脱尾等不良层析行为 控制流动相pH，硅胶表面均匀覆盖非极性配基，屏蔽残余硅醇基，可基本排除亲硅醇基效应的影响; 新型反相层析介质聚苯乙烯等高分子聚合材料的开发可根本消除亲硅醇基效应的影响。 2.2 反相层析的分离过程 起始阶段：用具有合适pH、I和极性的流动相A平衡反相层析柱 吸附样品：加样至层析柱，洗去未结合的溶质 开始解吸：通过调节流动相极性等方式将反相介质上吸附的溶质顺序解吸 完全解吸：移除前一步未解吸的物质 再生：介质从100%流动相B重新过渡到流动相A 3 反相层析介质 3.1 介质的构成 基质：硅胶、聚苯乙烯等 配基：正烷烃基团（n-烷基），常用的有辛基（C-8）和十八烷基（C-18），其他还包括丙基、丁基、丙基苯基、二苯基等 3.1.1 基质 硅胶 优点：机械强度高，能承受高压、高流速，理化稳定性好，多孔性结构 缺点：高pH条件下会溶解，并且会产生负电荷，对分离造成不良影响，只能在酸性条件下使用 聚苯乙烯 在强酸强碱性条件下稳定性好，不产生亲硅醇基效应 3.1.2 配基 正烷烃基 n-辛基 n-十八烷基 n-丙基 二苯基等 3.1.3 配基与基质的偶联 用氯化三甲基硅烷或氯化三乙基硅烷封阻硅胶表面残留的硅醇基 配基较大时，由于空间位阻效应，导致亲硅醇基效应存在 3.2 反相层析介质的性质 粒径 RPC是与HPLC技术伴随发展的，有着高分辨率，反相介质的粒径一般在5~30μm之间，小于常用的凝胶过滤介质和离子交换剂，有着较高的柱效 分析型应用： 15μm介质 制备型应用： 15μm介质 孔径 通常在10～50 nm之间，孔径的大小直接影响到有效结合容量，10 nm左右孔径的介质分离小分子物质，孔径在30 nm以上的介质分离生物大分子 配基密度 通常情况下反相介质有着较高的配基密度 当配基链长超过C6时，配基密度在同一数量级时对相对保留值的影响很小 结合容量 每毫升反相介质能结合溶质的毫克数（mg溶质/mL介质），分为静态结合容量和动态结合容量 结合容量取决于溶质的分子大小、疏水性，介质的多孔性、配基密度，流动相的组成、pH，操作流速等 机械强度 用最大操作压力（MPa）或最大线性流速（cm/h）表示 稳定的理化性质 3.3 常见的反相层析介质 3.3.1 SOURCETM RPC系列 基于聚苯乙烯的反相介质，用于肽、蛋白质、寡聚核苷酸等的分析型和制备型分离纯化，能够在高流速条件下实现对样品的快速、可重复、高容量和高分辨率分离 根据介质的粒径不同，该系列包括SOURCE 5RPC、SOURCE 15RPC和SOURCE 30RPC三个规格 SOURCE RPC系列介质的主要特性 SOURCE RPC 良好的重复性 优秀的放大能力 优秀的流速/压力特性 3.3.2 μRPC C2/C18系列 是以粒径为3μm的多孔硅胶微粒为基质，键合二碳和十八碳的烷烃基团形成的反相介质 具有非常小的粒径，具有很高的效率和优秀的分辨率，十分适合于用于肽谱分析，分析型和极微量纯化过程。 以预装柱形式出售，有两种不同的规格 μRPC C2/C18 PC 3.2/30 μRPC C2/C18 PC 2.1/100 μRPC C2/C18反相层析柱的特性 3.3.3 Se