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Trizol使用说明书 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化 RNA。RNA 质量的高低常常影响 cDNA 库，RT-PCR 和 Northern Blot 等分子生物学实验的成败。Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试 剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。 二、用户需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、Glycogen （可能需要）、 1.5ml Eppendorf 管 （RNase-free）、 Tips （RNase-free） 三、准备工作 RNase 酶非常稳定，是导致 RNA 降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但 限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase 完全 失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与 RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。 RNase 的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用 DEPC 配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取 RNase-free 的物品时必须戴 手套。 1、 料制品的处理 尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明 RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通 常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下： 1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC 使 DEPC 的终浓度为 0.1%。注意：DEPC 为剧毒物，活 性很强，小心在通风柜中使用。 2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入 DEPC 水溶液，使塑料制品的所有部分 都浸泡到溶液中。 3）在通风柜中室温处理过夜。 4）将 DEPC 水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已 DEPC 水处理过的塑料制品的烧杯，高温 高压蒸气灭菌至少 30 分钟。 5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 2、 璃玻和金属物品 250°C 烘烤 3 小时以上。 1 热线电话：021－5446 0832 8009881995 E-mail:master@ 网址： 四、从组织中提取总RNA 1)液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮， 再研磨，如此三次，按 50-100mg 组织/ml Trizol 加入 Trizol，转入离心管进行第 2 步操作。 2) 匀浆：组织样品按 50-100mg/mlTrizol 加入 Trizol。另外，组织体积不能超过 Trizol 体积 的 10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需 1-2 分钟。 五、从细胞中提取总 RNA 2 1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按 10cm /ml比例加 入。 6 7 2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每 1ml Trizol可裂解 5×10 动物、植物或酵母细胞，或 10 细菌 细胞。 六、操作步骤 1、细胞或组织加Trizol 后，室温放置 5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。 2、12,000rpm 离心 5min，弃沉淀。 3、按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，振荡混匀后室温放置 15min。注：禁用漩涡振荡器，以 免基因组 DNA 断裂。 4、4℃ 12,000g 离心 15min。 5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取 DNA 和蛋白质， 则保留下层酚相存于 4℃冰箱,若只提 RNA，则弃下层酚相。 6、按 0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置 5-10min。 7、4℃ 12,000g 离心 10min，弃上清，RNA 沉于管底。 8、按 1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。