sA二级结构的研究详解.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（１２）：１３１９ 化脓链球菌中铁结合蛋白ＭｔｓＡ二级结构的研究 王红翠　张　静　徐　倩　许丽娜　王南杰　孙雪松 （暨南大学生命与健康工程研究院　广州　５１０６３２） 摘要　化脓性链球菌是一种革兰氏阳性人类致病菌，其生长和感染离不开铁离子。ＭｔｓＡ是化脓 链球菌中直接结合铁离子的一个脂蛋白。通过 ＰＣＲ扩增化脓性链球菌ＭＧＡＳ５００５中的ＭｔｓＡ基 因，构建高效表达质粒ｐＧＥＸＭｔｓＡ，将其转化到大肠杆菌ＢＬ２１中并用ＩＰＴＧ进行诱导表达。利用 亲和层析方法纯化表达产物。通过多序列比对分析了ＭｔｓＡ铁结合中心的保守性，利用定点突变 技术将ＭｔｓＡ的结合配体单位点及多位点进行突变，结合圆二色谱分析这些氨基酸突变后蛋白二 级结构的变化。多序列比对结果表明ＭｔｓＡ结合铁离子的氨基酸位点是保守的，４个关键氨基酸 位点处于蛋白空间的凹陷处。通过比较空载及饱和铁离子的野生型蛋白以及突变体蛋白的圆二 色吸收光谱，发现野生型ＭｔｓＡ结合铁离子后结构更加紧密，Ｈ６８Ａ，Ｅ２０６Ａ和 Ｄ２８１Ａ则比野生型 的二级结构松散，而Ｈ１４０Ａ的二级结构和野生型的几乎没有差别。对ＭｔｓＡ４个结合配体突变后 其二级结构变化的研究，为进一步研究细菌中的铁转运机理及开发疫苗候选药物和药靶奠定了 一定的理论依据。 关键词　化脓链球菌　ＭｔｓＡ　定点突变　多序列比对　圆二色谱法 中图分类号　Ｑ８１９ 　　化脓性链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）是一种不运 菌中具有高度的保守性，且其中的脂蛋白暴露在细胞 动性革兰氏阳性菌，是目前致病性最强的一种链球菌。 膜外，因此可以成为预防和治疗这些细菌引发的感染 ［６７］ 它能产生多种毒素（链球菌溶血素、猩红热毒素）、脂磷 性疾病的疫苗候选物和药靶 。在化脓链球菌中，目 壁酸、链激酶等致病因子，从而引起一系列皮肤和粘膜 前共报道已知 ３种铁转运的 ＡＢＣ系统：ＭｔｓＡＢＣ、 感染等疾病，如咽炎、猩红热、脓包型皮肤病、侵袭性的 ＨｔｓＡＢＣ和ＦｔｓＡＢＣＤ，它们分别转运铁离子，血红素和铁 ［８］ 深层组织感染和链球菌引起的中毒性热休克综合 色素 。 征［１］。化脓性链球菌的毒性常受生长阶段和环境信号 　　在化脓链球菌中，ＭｔｓＡＢＣ是一种典型的ＡＢＣ转运 的影响，如温度、渗透压、ｐＨ、铁离子的浓度、Ｏ 和ＣＯ 体，其包含一个脂蛋白ＭｔｓＡ，一种 ＡＴＰ结合蛋白和一 ２ ２ ［２］ 个跨膜蛋白。ＭｔｓＡ直接捕获游离的铁离子，然后与跨 分压控制 。 　　铁离子是细菌生存和对宿主形成感染的必需微量 膜蛋白体系相互作用并将其转运给跨膜蛋白，在这个 元素，它是细胞代谢过程中许多蛋白或酶的辅助因 过程中ＡＴＰ结合蛋白为铁离子释放到体内提供能 ［９］ ［３５］ 量 。作为ＭｔｓＡＢＣ中的一个重要组分，到目前为止， 子 。细菌需要从宿主环境中获取足够的铁离子以 维持自身生命进程，然而宿主细胞外的铁离子含量非 ＭｔｓＡ的三维结构已经被解析，它的铁结合中心由６８位 常有限，针对这一问题，细菌进化出了对铁离子具有高 组氨酸、１４０位组氨酸、２０６位谷氨酸和２８１位天冬氨酸 ［１０］ 度亲和力的ＡＢＣ转运铁系统，该系统在革兰氏阳性细 构成 。另外，相关实验还发现ＭｔｓＡ对不同的金属离