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小白菜自交不亲和性相关基因的分子标记开发 　　摘要：以自交亲和系WS-199和自交不亲和系WS-85为亲本杂交获得的F2分离群体为供试材料，采用BSA法结合SNP芯片技术，筛选出与自交不亲和性相关的SNP标记，并将SNP差异位点序列信息与白菜基因组序列进行比对分析，并进一步开发SSR标记，共获得了与自交不亲和性相关的SSR分子标记BrA1-2、BrA1-3和BrA1-14，为分子标记辅助自交不亲和性杂交种生产提供技术支持 关键词：小白菜；自交不亲和性；SNP；分子标记 中图分类号：S634.3 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2016）08-0038-04 小白菜（Brassiea eampestris ssp.chinensis Makino）又称不结球白菜，营养价值丰富，生长期短，在适宜环境条件下可进行周年种植，为我国长江中下游及南方地区种植的重要蔬菜种类之一。小白菜的自交不亲和现象十分普遍，利用自交不亲和系生产F1代杂交种成为小白菜杂种育种的重要方法之一。但是，由于自交不亲和的表型容易受到环境条件和植株生理状况的影响，导致植株的亲和性难以判断，致使在配置杂交组合和种子生产时，费时费力，准确性差。利用分子标记辅助选择，可以大大提高育种的效率 小白菜自交不亲和性主要由s位点复等位基因控制。当雄蕊花粉粒携带的s等位基因与雌蕊的基因相同时，花粉管生长受到抑制，表现出自交不亲和；当花粉粒携带的s等位基因与雌蕊的基因不相同时，花粉管正常生长，表现为自交亲和。在育种实践中，能够快速鉴定自交不亲和性的S单元型至关重要。随着分子生物学的发展，利用分子标记鉴定S单元型已成为目前主要的方法之一。前人做了很多研究，Nasrallah等利用SLG6的cDNA克隆作为探针，对多个不同S单元型的全基因组DNA进行RFLP分析，获得了多个与S单元型连锁的RFLPs标记，初步建立了一种利用DNA分子标记技术快速鉴定s单元型的方法，可以在苗期鉴定材料的S单元型，比田间更加可靠；Nishio等利用PCR-RFLP对10个白菜和10个甘蓝材料的SLG基因多态性进行了分析，发现这种方法可以在十字花科的蔬菜中鉴定S单元型以及F1杂种的纯度。寇小培以甘蓝型油菜为材料，利用与自交不亲和基因连锁的分子标记辅助选育油菜自交不亲和系，最终得到了改良的甘蓝型油菜自交不亲和系。因此，分子标记在自交不亲和性中的利用越来越重要，而开发新的自交不亲和性标记成为当前的重点 本研究以自交亲和系WS-199和自交不亲和系WS-85为亲本构建的F2分离群体为材料，采用BSA法和油菜60K SNP芯片杂交技术，对小白菜自交不亲和性相关基因的分子标记进行设计与开发，为后续利用自交不亲和性进行分子标记辅助育种提供可靠的理论依据与技术支持 1材料与方法 1.1试验材料 供试材料为自交亲和系WS-199和自交不亲和系WS-85（由武汉市蔬菜科学研究所栽培与采后室提供）为亲本构建的F2分离群体。于2014年9月底，将F2群体种子播于大田，2015年1月将幼苗移栽到大棚中（武汉市黄陂区武湖基地），2015年3月进行套袋自交。所有材料依照田间常规方法进行种植和管理 1.2试验方法 ①F2群体亲和性调查、DNA的提取及BSA混池构建 a.F2群体亲和性调查。在2015年3月对F2群体中的开花植株进行套袋自交，调查植株的角果生长和膨大情况，以及植株的结实情况，最终判断植株的亲和性 b.DNA提取。选取苗期的小白菜鲜嫩叶片，采用改良CTAB法提取DNA。用UV-1800 PC紫外分光光度计（上海谱达仪器有限公司）测定DNA浓度，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，取部分原液稀释到50 ng/mL作模板，其他放于-20℃保存备用 c.BSA混池构建。从群体中选取性状明显的亲和系植株和不亲和系植株各17株，采用DNAsecure Plant Kit新型植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，产品编号DP320）提取DNA，且DNA样品保存在-80℃。利用组群分离分析法（BSA）构建不亲和池与亲和池，对DNA进行等量混合，构成4个不亲和基因池与4个亲和基因池，用于芯片分析及后续引物筛选 ②SNP芯片设计采用油菜60K SNP芯片进行杂交。a.DNA定量、扩增。放在0.1 mol/L NaOH中变性，加入MA2和MSM，放在37℃杂交炉中扩增20～24 h b.DNA片段化。加入FMS，在37℃干浴锅1 h c.DNA富集。加入155μL异丙醇，在4℃冰箱中放置30 min，倒出液体，室温下干燥1 h d.DNA片段回收。加入RA1，用银箔纸封口，在48℃杂交锅中培养1 h e.DNA变性。在干浴锅于95℃下