选修一知识点概括.ppt

无菌技术措施的选择原则 (1)考虑效果：灭菌的效果比消毒要好 (2)考虑操作对象的承受能力： 接无菌技术措施的选择原则种环或接种针等金属用具一般用灼烧灭菌；培养皿等玻璃器皿用干热灭菌；培养基用高压蒸汽灭菌。操作者双手一般用酒精擦拭，即化学消毒。牛奶用巴氏消毒法。 酒精消毒液中酒精浓度对效果的影响： 70%的酒精杀菌效果最好。原因是浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱 1．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 (1)流程：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。 (2)应注意的问题 ①全程要求无菌操作，无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。 ②熔化琼脂时，要不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。熔化后应调节pH后再分装，装入锥形瓶的量以不超过锥形瓶容积的一半为宜。 ③培养基用高压灭菌锅灭菌后，需冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。操作时使锥形瓶的瓶口通过火焰灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 ④平板冷凝后皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高。因此需将平板倒置，这样既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 ⑤在倒平板的过程中，不能将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 2．纯化大肠杆菌的方法 (1)平板划线法： ①平板划线操作及培养结果：接种环在固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐步分散到培养基的表面。 ： ②每次划线前后都要进行灼烧接种环的目的 (2)稀释涂布平板法： ①主要操作环节：系列稀释和涂布平板 ③稀释涂布平板法操作比较复杂，且各个细节均需保证无菌操作，应特别注意： a．酒精灯与培养皿的距离要适宜。 b．吸管头不要接触其他任何物体。 c．吸管要在酒精灯火焰周围使用。 d．涂布器末端浸在盛有酒精的烧杯中，取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃，注意防火 备注：1．单细胞菌落的获得 (1)利用平板划线法接种时，单细胞菌落从后划线的区域挑取。 (2)利用稀释涂布平板法接种时，只有合适的稀释度才能得到单细胞菌落。 2．两种接种方法的异同 ：两种方法都能将微生物分散接种到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离的目的；稀释涂布平板法还能对微生物计数。 课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 一、筛选菌株的思路及统计菌落数目的方法 1．筛选菌株的思路 (1)自然界中目的菌株的筛选 ①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 ②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的TaqDNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。 (2)实验室中目的菌株的筛选 ①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 ②方法：利用选择培养基分离 二、实际设计及操作提示 1．实验设计 3．菌种鉴定 (1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。 (2)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。 ③注意事项 a．为了保证结果准确，一般设置三个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。 b．统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 c．设置对照：主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 (2)其他方法：利用显微镜直接计数。 直接计数法与间接计数法的比较 1．实验设计原则 (1)设立重复组： 统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布三个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。 (2)设立两种对照组： ①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的选择培养基同时进行培养。 ②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论 * 杀死接种环上残存的菌种，避免污染环境或感染操作者 接种结束后 杀死上次划线后残留在接种环上的菌种，使下次划线的菌种直接来自上次划线末端，使每次划线菌种数目减少，达到分离菌体的目的 每次划线前 杀死接种环上原有的微生物，防止外来微生物干扰 第一次 目的 灼烧时间 每毫升原液含菌株数＝×稀释倍数 每毫升原液含菌株数＝400×10 000×每小格平均菌株数×稀释倍数 计算 公式 操作较复杂，且有一