PCR新技术及其应用(一).pdfVIP

Karl Wang 上海迈培光电技术有限公司 聚合酶链 （式）反应（Polymerase Chain Reaction, PCR) ，是体外扩增DNA序列的技术。该技术与分 子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个现代分 子生物学实验的工作基础。 PCR基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板， PCR基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板， 以一对分别与模板相互补的寡核苷酸片段为引物， 在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿 着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不断重复这 一过程，可使目的DNA得到扩增。 PCR包括7种基本成分：模板、特异性引物、热稳 定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、二价阳离子、缓 冲液及一价阳离子。 模板就是待扩增序列的核酸，基因组DNA、质粒 DNA、噬菌体DNA、cDNA、mRNA。 DNA、噬菌体DNA、cDNA、mRNA。 引物是与靶DNA3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸 片断。一般来说，引物越长，对于靶序列的特异性 也越高。为节省时间，可以使用计算机进行引物设 计。 热稳定DNA聚合酶，是从两类微生物中分离得到： 一类是嗜热和高度嗜热真细菌，它的大量DNA聚合 酶类似中温菌的DNA聚合酶I；另一类是嗜热古细 菌，其主要DNA聚合酶属于聚合酶α家族。 脱氧核苷三磷酸 dNTP)，标准PCR反应体系中包含 脱氧核苷三磷酸 dNTP)，标准PCR反应体系中包含 四种等物质的量浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP， dTTP，dCTP和dGTP。 阳离子，一价如Mg2+和Mn2+ 。 TrisCl缓冲液，浓度10mmol/L，pH值8.3~8.8。 PCR的基本反应由三个步骤组成： 变性，通过加热使模板DNA完全变性成单链，同时 引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除； 退火，将温度降低到适宜温度，使引物和模板DNA 退火结合； 退火结合； 延伸，将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为 底物催化合成新生DNA链延伸。 对于PCR的产物通常使用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯 酰胺凝胶电泳检测，还可通过荧光仪检测或将检测 结果数字化。 1996年，实时荧光PCR技术有美国ABI （Applied Biosystems）公司首先推出。 所谓实时荧光PCR，指在PCR指数扩增期间通过连 续检测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变 化来及时分析目的基因的拷贝数目，通过与加入已 化来及时分析目的基因的拷贝数目，通过与加入已 知量的标准品进行比较，可实现实时定量。