实时荧光定量PCR技术课件.pptVIP

实时荧光定量PCR技术;主要内容;主要内容;PCR技术简介 PCR: polymerase chain reaction多聚酶链式反应英文词首字母的缩写，是一种体外选择性扩增DNA或RNA片段的方法。其基本原理是依据DNA双螺旋结构及其半保留复制特性，用人工合成的小片段;PCR技术简介 寡核甘酸引物与经高温（变性温度）变性形成的单链DNA模板，在特定温度（复性温度）下产生序列特异性互补结合，在适当温度（延伸温度）条件下，由DNA多聚酶催化使已经结合的寡核甘酸引物沿模板序列延伸产生与模板序列;常规PCR 完全互补的新的DNA单链。 PCR技术自1985年由美国PE公司的Mullis等发明并推出市场应用以来，实现了小片段DNA的体外快速扩增，为各种因DNA序列的变异、缺失以及由此导致的遗传缺陷和相关疾病的研究和临床诊断提供了强有;常规PCR 力的手段，为各种病原体包括微生物、细菌、病毒等所致疾病的快速确诊提供了技术条件，极大地促进和加速了整个生命科学研究的进程。;常规PCR的定量 在PCR反应中，理论上扩增产物的量与起始样本中模板的含量成正比。但受多种因素的影响，其精确定量模板的可信度明显不足。为克服上述不足，人们设计出包括内标、竞争、酶联、尿苷酶降解等多种定量方法。;内标法 在不同的PCR反应管中加入已知量的内标模板和引物，内标模板可由基因工程合成或采用已知量的标准品。在样品模板扩增的同时，内标模板也被扩增。二者的扩增产物可通过电泳或其它方法分离，以内标为对照进行样本模板定量。;竞争法 将含有一个新内切酶位点的外源性模板加入PCR反应管中，待测样品模板与外源性模板用同一对引物进行扩增，经内切酶消化竞争性模板的产物成为两个片段，通过电泳等分离检测，根据已知模板的量推测未知模板的起始拷贝数。;酶联免疫 利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固定在固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素抗体－辣根过氧化物酶结合物，检测酶底物显色情况，通过内标－标准曲线实现定量检测的目的。;参照物在PCR定量中的作用 作为扩增系统的阳性对照； 作为未知样本定量的参比标准； 通过竞争性作为矫正扩增系统内部的 扩增效率，使其具有可比性。 （参照物按其性质不同可分为内标和外标）;内标基因的选择;传统PCR定量方法的特点和不足 1.定量的准确度：传统PCR定量方法的共同特点是针对PCR扩增的最终产物进行分析。因受酶活性、扩增效率、尤其是平台效应等诸多因素的影响，检测重现性极差，无法直接从终产物量推算出起始模板的精确含量。;传统PCR定量方法的特点和不足 2.假阳性污染：传统PCR定量方法均依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，这些过程极易使数量巨大的PCR扩增产物飞散到实验室的环境中，造成待检样本的污染，导致假阳性结果的上升。;实时荧光定量PCR 在PCR反应体系中引入DNA结合荧光染料或荧光探针，对每一循环扩增反应产物DNA片段的累积情况进行实时监测记录，通过数学模型实现对起始模板的定量及定性的分析。其特点为全封闭（污染少）、高精确、高灵敏。;实时荧光定量与常规PCR的区别;PCR;在实时荧光定量PCR技术中常用的概念 荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）：在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一基团（受体）的激发光谱有一定的重叠，当两个基团之间的距离足够近（小于100?）时，以供体基团的激发波长进行激发，可获得由受体基团发射的荧光。;荧光共振能量转移 即：在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量直接转移给了受体。在此过程中没有光子的参与，是非辐射性的能量转移过程，转移效率与供－受体两个基团之间距离的6次幂倒数成正比例。;FRET产生条件; 2 供体和受体的距 离足够近：1-10nm （1－10nm为分子内/ 间互作的距离： 如蛋白质构象转 变、酶催 化反 应等。） ——超显微观察 3 合适偶极方向 4 足够荧光寿命 ;荧光域值线（fluorescence threshold line）：背景荧光与荧光信号的分界值，可以通过标准曲线或经验来设定，常设定为初始3-7个循环荧光值标准差的10倍。;Threshold line ;;Determine C(t) value for unknown Interpolate quantity of unknown using the standard curve;用Ct值定量的意义 实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细