真核细胞DNA提取与酶切鉴定-liuchang课件.ppt

酶切体系： 10×反应缓冲液：提供内切酶反应最适 pH值及所需离子。 内切酶：含50%甘油，－20℃保存。 反应体积：一般根据底物DNA的量来计算。反应体系中甘油浓度应10%。 双蒸水：无细菌和其他酶类污染。 琼脂糖凝胶电泳常用试剂 上样液成份：(10×Loading Buffer) 1）0.25%溴酚蓝或/和0.25%二甲苯酚---样品指示剂。 2）40%蔗糖 或 30% 甘油 ---增加样品比重，利于加样。 电泳缓冲液： TAE 为例: T: Tris碱 A: 冰乙酸 E: EDTA pH值(8.0) 具有缓冲能力, EDTA可抑制DNA酶活性。 DNA的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合链线性分子。 线性DNA分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比 DNA的空间构型不同，即使分子量相同其迁移率也不相同 核酸电泳的染色剂 最常用的是溴乙锭染色法。 (ethidium bromide，EB) 对1ng RNA，DNA均可显色。 EB染料是一种强烈的诱变剂，操作时应注意防护，应戴上聚乙烯手套。 在紫外线激发下，发出红色荧光(590nm） 。 ? 微量加样器的使用 There three sizes of pipette which are capable of pipetting three ranges of volumes: Pipette type Volumes (μL) Tip color P20 0.5 – 20 white P100 20 – 100 yellow P1000 200 – 1000 blue  实 验 结 果 酶切后的基因组DNA 基因组DNA * * 哺乳动物DNA的分离通常是在有EDTA及SDS一类的去污剂存在下用蛋白酶K消化细胞．随后用酚抽提而实现的。低分子量杂质则用透析法加以去除。这一方法获得的DNA，其大小(100—150kb)适用于Southern分析和用噬菌体构建基因组DNA文库。然而，若要用粘粒成功地构建文库则要求更大的DNA。 —端受到剪切而另一端则由限制酶切割产生的DNA片段，可在连接反应中争夺粘粒DNA，从而有效地阻碍了可被包装进曙菌体颗粒的多联体的形成。为避免出现这—问题，初始DNA的长度需数倍于用来构建文库的部分酶切产物。图9．2表示两端均适于克隆的部分消化产物所占组分与基因组DNA的初始长度的相互关系。DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍，否则生成的有效片段相对较少。因此，用就粒构建基因组DNA文库，初始DNA的长度应大干200kb。对于涉及有机溶剂抽提和机械剪切作用的方法来说，分离这样大小的DNA片段是困难的，因为在这些步骤里，DNA发生大量丢失。从哺乳动物细胞和组织中分离DNA的三种程序。 * 人体内的血液量大约是体重的7-8％，如体重60公斤，则血液量约4200-4800毫升。 血小板（blood platelet）是哺乳动物血液中的有形成分之一。形状不规则，比红细胞和白细胞小得多，无细胞核，成年人血液中血小板数量为100~300×1000000000个/L，它有质膜，没有细胞核结构，一般呈圆形，体积小于红细胞和白细胞。 无核盘状小细胞血小板（blood platelet），简称:PLT。是哺乳动物血液中的有形成分之一，是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质。体积小，无细胞核，呈双面微凸的圆盘状，（100~300）×10^9个/L，直径为2-3微米。血小板在长期内被看作是血液中的无功能的细胞碎片。血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中有较恒定的数量（如人的血小板数为每立方毫米10～30万），在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用。血小板只存在于哺乳动物血液中。没有细胞核结构，即没有染色体。 * 　　如急性大失血，引起血压下降时，则应输全血。严重贫血者由于红细胞数量不足，而总血量不一定少，故最好输以浓缩的红细胞悬液；患大面积烧伤的病人，主要是血浆减少，最好输以血浆或血浆代用品；对某些出血性疾病的患者，则可输入浓缩的血小板悬液或含有凝血因子的血浆以增强凝血能力促进止血。 * ?SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。 蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋