实验二 血糖定量测定ppt课件.pptVIP

分光光度计的组成和构造 组成：各种型号的紫外/可见分光度计，不论是何种型式，基本上都由五部分组成： （1）光源； （2）单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）； （3）样品室； （4）接收检测放大系统； （5）显示或记录器。 国产分光光度计近年来已有很大的发展，各种档次的分光光度计都已更新升级换代，可见光系列有：721、722、723等型号，紫外/可见光系列有：751、752、753、754、756等型号。 分光光度法在生化实验技术中的应用 　　 　　　因为分光光度法极为灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分的系统中，不需要分离，即能检测出其中所含有的极少量物质。因此，分光光度法目前已成为生物化学及其他生物科学相关领域研究中广泛使用的方法之一。 在生化实验中主要用于氨基酸含量的测定、蛋白质含量的测定、核酸的测定、酶活力测定、生物大分子的鉴定和酶催化反应动力学的研究等。 754型操作规程 开启电源，用可见光测定时打开钨灯即可，如使用紫外测定则还需打开氘灯，指标灯亮，使仪器预热20min以上。 按“Mod”键选择测试方式，使开关置于T。 打开样品室盖（光门自动关闭），按0％T键进行机械调零，使数字显示为“0.00”。 将参比样品和被测样品分别倒入比色皿中，放置比色架中，旋动波长调节旋钮，把测试所需的波长调节至刻度线处。 盖上样品室盖，将参比溶液比色皿置于光路，调节透过率“100”按钮，使数字显示为100％T。然后按“Mod”键选择开关置于“A”，使显示数字为“0.000”，反复转换“A”、“T”为0、100三次，可进行吸光度值测量。 吸光度A的测量：按“Mod”键选择开关置于“A”使得参比溶液数字显示为0.000，然后移入被测溶液，显示值即为试样的吸光度A值。 测量完毕后，关闭电源，清洗比色皿。 仪器使用结束后，按要求填写仪器使用登记。 注意事项： １、每台仪器所配套的比色皿是通过透射配对的，不能相互调换。 ２、使用比色皿时要将透光面对准光路，勿用手触摸比色皿透光面，比色皿盛液约2/3左右，溶液中不能有气泡、悬浮物等，以免影响测试精度。 ３、只能在“T”档时打开样品室盖。 ４、开关盖子及推拉转换时，轻拿轻放，以免溶液溅出腐蚀仪器。 ５、清洗比色皿的过程中，光面只能用擦镜纸擦。 血糖定量测定(Folin-Wu法) Cu2+( CuSO4 ) 　　还原糖 Cu+(Cu2O) Cu2O +酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物 实验操作 １、配制标准葡萄糖液 ２、无蛋白血滤液制备 　　　用１ml移液管准确吸取抗凝血１ml，缓缓放入２０ml锥形瓶内，加水７ml，溶血后加１０％钨酸钠１ml，摇匀，再加０.３３mol/LH2SO4１ml，随加随摇，加毕充分摇匀，放置５～１５分钟，至沉淀由鲜红变成暗棕色。用干滤纸过滤（先倾入液体少许，待滤纸润湿后再全部倒入），并在漏斗上盖一表面皿。如滤液不清，需重滤。每毫升无蛋白血滤液相当于１／１０ml全血。 思考题： Folin-wu血糖管的中间部分变细有什么作用？ * 实验二 血糖定量测定(Folin-Wu法) 有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。分光光度法是利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的技术。使用的仪器则称为分光光度计 。 分光光度技术 实验原理 　　葡萄糖的醛基具有还原性。无蛋白血滤液中的葡萄糖与碱性铜试剂混合加热后，被氧化成羧基，而碱性铜试剂中的二价铜则被还原成砖红色的氧化亚铜（Cu2O）沉淀。氧化亚铜又可使磷钼酸还原成低价的蓝色钼化合物。血滤液中的糖含量和产生的氧化亚铜量成正比，氧化亚铜的量与形成钼化合物的量成正比，可用比色法于４２０-４４０nm下测定。 　　测定血糖含量时必须先除去其中的蛋白质，制成无蛋白滤液，再行检验。向抗凝血中加入钨酸钠、硫酸锌、氢氧化锌及三氯乙酸等均可制得无蛋白滤液，现常用钨酸法。钨酸钠与硫酸作用，生成钨酸，可使血红蛋白等变性、凝固、沉淀，离心或过滤除去沉淀，即得无蛋白血滤液，此种滤液还适用于测定非蛋白氮、肌酸和尿酸等 　　 Na2WO4 + H2SO4 → H2WO4 + Na2SO4 ２.０ ２.０ ２.０ 酸性磷钼酸试剂 混合，置沸水浴中加热８min，于流动冷水中冷却３min（勿摇动） ２.０ ２.０ ２.０ 碱性铜试剂 ０ ２.０ － 葡萄糖标准液（工作液） ０ ０ ２.０ 蒸馏水 ２.０ － － 无蛋白血滤液 样品 标准 空白 　　　　　　血糖管 试剂（ml） 　　混匀，