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实验七 微生物大小和数量的测定 目的要求 1、掌握用显微镜测微尺测量微生物大小的基本原理及方法。 2、利用血球计数器，进行微生物数量的直接测定，并掌握其原理和传统方法。 实验内容一利用显微镜测微尺测量微生物大小 显微镜成像原理 经过显微镜物镜和目镜的二级放大，形成肉眼可见的放大的物像（虚像） 构造及原理 目镜测微尺——安装于显微镜的目镜部位； 镜台测微尺——校正时放置于显微镜的载物台上（样品处），测量时不需要； 利用镜台测微尺（已知刻度长度）校正目镜测微尺在不同物镜下代表的实际长度（μm） 利用镜台测微尺校正目镜测微尺 显微镜测微尺的组成 目镜测微尺——肉眼可见物像为一级放大（7种，根据测定的材料不同进行选择）。 镜台测微尺——肉眼可见物像为二级放大，和观察样品处于同一焦面。 不可能利用真正的尺子来进行测量（微小）； 不可能制成（或制作成本过高） 不可能和所观察样品同时使用 只能用虚拟的尺子进行测量（物像）。 标定 镜台测微尺在4×物镜下的情况 镜台测微尺在10×物镜下的情况 镜台测微尺在40×物镜下的情况 说明： 镜台测微尺刻度距离的物像随物镜的变化而变化（由小变大）； 目镜测微尺刻度距离的物像在目镜不变换的情况下，是不随物镜的变化而变化。 目镜测微尺校正（代表）尺寸随物镜放大倍数增大成反比例减小。 注意： 刻度的刻线会随物镜的放大倍数而变粗（物像）； 校正的目镜测微尺在不同物镜下代表的长度是和物镜的放大倍数成反比的； 实际校正过程中，会因加工精度和刻度的放大出现微小误差。 实验步骤 菌种： 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ） 1、放置目镜测微尺（已放好，或直接使用测微目镜） 2、放置镜台测微尺（1毫米被100等分，放于载物台上） 3、校正目镜测微尺（不同物镜倍数） 4、用校好的目镜微尺测定酵母菌大小（10个细胞，同时观察酵母菌形态），计算平均值 5、微生物的大小表述：宽×长（μm） 说明： 微生物（其它生物也有类似的情况）的大小是有一定范围的，实际表述为0.5~1.0×4.0~ 7.0μm（举例） 目镜测微尺校正结果 微生物大小测定结果 实验内容二利用血球计数板测定酵母细胞数 显微镜直接计数法是将待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计数器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 国内常用的计数器有血球（血细胞）计数板、 Petroff-Hausser计菌器及Hawksley计菌器。 血球（血细胞）计数板是一块特制的载玻片，由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短槽隔成两半，每一边的平台各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。 不同规格血球计数板的计数室 血球计数板的大方格显微照片 血球计数板的中方格及小方格显微照片 实验步骤 菌种： 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ） 稀释→镜检计数室（熟悉计数室结构） → 盖上盖玻片→加样品（不能有气泡）→静止5分钟左右→显微镜计数（5个中方格）→清洗血球计数板→利用吸水纸擦拭干净。注意观察出芽情况，计算总菌数、出芽率。 计算公式：（B=100） 将结果记录于下表中A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。 注意： 位于格线上的菌体一般只计入上方和右边线上的细胞； 对于酵母菌来说，出芽生殖的芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体（细胞）计数，反之，计为一个； 血球计数板只适用于计数单细胞生物； 细菌等原核生物因需要在油镜下观察，一般血球计数板不能使用，而采用Petroff-Hausser计数板（进口购买，其计数室有效空间高度为0.02mm）。 附：活菌染色——美兰法 在显微镜下区分死活菌观察活菌的方法？注意死活菌的区分，分别计数，计算成活率。 原理： 活菌细胞新陈代谢中有大量脱氢作用，具有较强的还原性，可以使美兰褪色变成无色，活细胞不能染上颜色，死细胞被染上蓝色。 实验步骤 菌种： 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ） 操作步骤：取1mL细胞悬液放入一支小试管中，加入1mL 0.5%美兰溶液，混匀后立即制片观察（水封片），或利用血球计数板制片计数（可以区分死活细胞，计算出细胞的成活率）。 操作要求：动作要快，否则活细胞接触美兰染料过长也会死，一般要求在5~10分钟内完成计数。 思考题 1、记录实验结果 ，计算出菌悬液中酵母菌的大小、数量、出芽率和存活率。 2、试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用？ 3、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一菌体的大小时，其测定结果是否相同？为什么？ 4、注意观