细菌内毒素检查法SOP(陈魏制作)2.docVIP

细菌内毒素检查—凝胶法 标准操作程序 1.简述 本操作程序主要参照BP 2003 Appendix XIV C. Test for bacterial endotoxins中MethodA.Gel-clot method: limit testMethod B. Gel-clot method: semi-quantitative test以及《中国药典2010版附录ⅹⅡE细菌内毒素检查法》中凝胶法，结合实验室自身条件编写而成。 2.安全注意事项 由于细菌内毒素对人体有毒害作用，且鲎试剂对人的危害作用尚不明确。因此实验过程中一定要做好防护措施。 3.检验目的 检验供试品中的的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。 4.检验原理 本操作程序通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素。某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH 值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH 值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。(L) 药典有明确规定的按照药典规定值，如无规定需经计算得出，具体计算方法见各药典。 7.供试品最大有效稀释倍数(MVD)和最小有效稀释浓度的确定(MVC) 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数( 1→MVD )，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD，MVD=cL /λ。式中L 为供试品的细菌内毒素限值；c 为供试品溶液的浓度，当L 以EU / ml 表示时，则c为1ml / ml ，当L 以EU / mg 或EU / U 表示时，c的单位需为mg / ml 或U / ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1 ，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L ；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度EU / ml （商品包装上有标示）。 举例：设设鲎试剂的灵敏度为0.25 EU/ml，λ=0.25 EU/ml，英国药典规定柠檬酸的限值L为0.5 IU/mg(IU与EU等同)，由于柠檬酸为固体，则可以通过c=λ/L，确定最小有效稀释浓度，即MVC=0.25/0.5=0.5 mg/ml。 8.设备和试剂 8.1电子天平 8.2电热灭菌干燥箱，温度能达到250摄氏度 8.3恒温水浴，能满足恒温在37±1℃ 8.4涡旋混合器 8.5 无菌工作台 8.6微量加样器，200 ul 8.7去热源一次性吸头 8.8凝集管(10mm×75mm) 8.9管架 8.10锡纸 8.11鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号7.12细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药典生物制品检定所统一发放的标准品厦门鲎试剂实验厂有限公司,湛江安度斯生物有限公司及湛江博康海洋生物公司在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。10.1细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程参见标准品使用说明书）。待复核鲎试剂的准备0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1 ml分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟。λc)