LDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物过氧化物酶同工酶.pdfVIP

植物生理学通讯 第42 卷第4 期，2006 年8 月 7 13 LDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物过氧化物酶同工酶 王爽 陈卫良* 浙江大学生物技术研究所，杭州3 1002 9 Analysis of Plant Peroxidase Isoenzymes by LDS-polyacrylamide Gel Electro- phoresis (LDS) * WANG Shuang, CHEN Wei-Liang Institute of Biotechnology , Zhej iang University, Hangzhou 310029, China 提要 以高粱和甘蓝型油菜叶片为材料，用十二烷基磺酸锂不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(LDS)检测过氧化物酶同 工酶的结果表明，LDS的酶带条数比非变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(native PAGE) 明显增加，分辨率大大提 高，上样量少，胶片易保存；比复性电泳(G) 的步骤简单，电泳后无需除去LDS 即可直接按常规活性染色方法染 色。 关键词 LDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(LDS) ；过氧化物酶(POD) ；同工酶 过氧化物酶(peroxidase, POD)是一族能利用 材料与方法 H O 氧化供氢体的酶，由1 个糖蛋白和1 个氯正 2 2 1 实验材料 铁血红素IX 的铁卟啉辅基缀合而成(胡能书和万贤 苗高3~5 cm 的高粱(Sorghum bicolor L.) 品种 国19 85) 。它在高等植物中广泛而大量存在，是 ‘辽杂10 号’叶片和甘蓝型油菜(B rass ica nap us 植物中最重要的氧化还原酶类之一。它具有多种 L . ) 品种 ‘浙双7 5 8 ’的叶片。 同工酶，在植物不同的生长发育时期和不同的组 2 试验方法 织器官中，POD 同工酶的数目和活性都有很大变 2.1 样品的制备 称取高粱和油菜叶片各1.0 g，洗 化，因此，研究P OD 同工酶可以更好地用以了 净，用纱布吸干后，放入液氮中，在预冷的研 解和调控植物生长发育过程。 钵中加1 mL 提取缓冲液(0.1 mol·L- 1 Tris-HCl, pH 目前，研究POD 同工酶通常用非变性不连续 8.5)和0. 1 g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)研磨，匀浆以 聚丙烯酰胺凝胶电泳(n ativ e PA GE) (宋晓轩等 4 000 ×g 离心10 m in ，取上清液为粗酶液，分装 19 95) ，其特点是在电泳过程中可以保持酶的活 后贮存于-70℃冰箱中备用。以上操作均在0~4 ℃ 性，但这种电泳方法分辨率低，条带分离较模 条件下进行。 糊。姬生栋等(2000)用Neuhaus-Steinmetz 等( 1994) 2.2 蛋白质测定 参照Bradford ( 1976)检测法。 的复性电泳技术(sodium dodecyl sulfate-gelatin-poly- 2.3 电泳 acrylamide gel electrophoresis, G)研究小麦 2.3.1 native PAGE 参照Bollag和Edelstein ( 1992) P O D 同工酶，此法在染色前需要复性即除去 的方法，用非变性不连续聚丙烯酰胺垂直平板电 SD S ，染色较繁琐，实验操作技术要求也较高。 泳，浓缩胶为5%, 分离胶为7 .5% 。样品蛋白在 本文以高粱(S org hum b icolor L.) 和甘蓝型油菜 上样缓冲液中的终浓度为1 mg ·mL- 1 ，每孔上样量 (Brassica nap us L.) 叶片为材料，采用变性作用比 分别为5 、10 和20 L ，在稳压55 V 、4 ℃条件 下电泳6~ 7 h