第8章 细胞重组与克隆技术.ppt

第八章 细胞重组与克隆技术 一. 细胞重组 细胞重组(又叫细胞拆合)是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。 （一）特点与意义 细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但这是一种活体的自我装配，而细胞重组则是离体的装配过程。细胞重组技术将细胞融合技术与细胞核质分离等技术相结合，为重新构成不同类型的杂种细胞提供了可能。尤其是细胞重组结合基因转移技术可以人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物，因此细胞重组技术现已成为现代生物工程中令人瞩目的热点课题之一。只有了解了生物合成和细胞装配的全过程，才能实现掌握细胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性状和功能的工程细胞这一目标。从这点上讲，细胞器重组技术对于揭示细胞活动规律具有重要义。 （二）细胞重组技术 一般而言，细胞重组的方式基本分为以下三种： (1)胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。 (2)微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。 (3)胞质体与核体重新组合形成重组细胞。 胞质体是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。微细胞又可被称为微核体，是指含有一条或几条染色体(即只含一部分基因组)，外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。胞质体和微细胞与完整细胞融合后就能重组产生相应的杂合体。胞质杂种细胞是不同种系之间形成的一种真正的新型细胞，在适宜条件下能成功地生存下去。 上面第三种方法是一种非常重要的细胞重组技术。它是利用显微操作技术将一个细胞的核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核(细胞质)进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。涉及的细胞核质分离技术是把完整细胞的细胞核和细胞质用特殊方法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来。也可用紫外线照射把细胞中的核杀死，再用于细胞重组。 1. 显微操纵术 对于活细胞进行细胞器的拆合必须借助于显微操纵术，这是一项十分精细的操作技术。一般是在显微解剖镜下，将细胞置于消毒的培养液中，同时在器皿的周围围以冰块或置于冷却系统中以减慢细胞发育，然后借助一台专门的装置—显微操作仪，用细微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中去，可以挑去细胞核，人工造就去核细胞；也可以进一步作移核实验与电生理实验。用这种仪器能够进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位的变化等等。具体操作如下图： 2. 细胞分离技术 分离细胞主要是根据细胞本身的某些特殊性质来选择合适的分离技术来分离具有同一性状的细胞群。这些性质包括： (1)细胞大小。 (2)细胞密度。 (3)细胞表面电荷。 (4)细胞表面标志(亲外源凝结素和抗体)等。 (5)细胞中一个或多个成分的荧光强弱。 (6)细胞对其他介质的吸附作用 经常采用的细胞分离方法如下： (1)梯度沉降分离法 主要是根据细胞大小不同分离细胞。细胞在单位重力作用下，通过密度介质，或在低离心力作用下通过梯度密度溶液沉降。由于细胞大小不同，沉降速度不同，细胞大，沉降快。常采用适当的分离介质形成一定的梯度密度溶液，这些介质主要有：血清、蔗糖等。 (2)等密度沉降分离法 主要是根据细胞密度差异来分离细胞。细胞在连续密度梯度分离介质中，受强离心力的作用，最后到达与其密度相同的分离介质层面，并保持平衡。如果是非连续密度梯度介质中，细胞主要集中在介于其自身密度的两种密度介质交界面上，从而达到分离的。 (3)流式细胞仪分离法 这种方法是以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然后用超声波处理使其分散成单个细胞，再将细胞悬浮液通过一个直径为50μm的喷嘴变成极细小的微滴，每个微滴一般含有一个细胞，以10m/s的速度喷出。 3. 细胞破碎方法 细胞器的分离需要将组织细胞破碎，常用的方法包括： (1)超声波破碎法 原理是：超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传送至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击和振动产生的剪切力使细胞破碎。缺点是破碎过程中会产热，应该注意冷却。有些生物大分子不宜采用。 (2)反复冻融法 使细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱(-70 ℃)或液氮罐内冻结后，在37℃复温融化，重复3~4次操作使细胞壁破碎。 (3)化学裂解法 在细胞悬浮液中加入某些化学物质如十二烷基硫酸钠等使细胞膜裂解