植物细胞融合(实验)要领.pptVIP

第六章 植物细胞融合（实验） 二、细胞融合（cell fusion)概念 在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。 通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物个体，这个杂种后代有可能兼有两个上代的一些优良性状。 实际操作： 先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成项链状排列； 再用1~5V/cm直流电脉冲/微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。 四、实验材料、试剂和仪器1.材料 无菌烟草叶片、洋葱根尖 3.仪器 1）大型仪器： 高压灭菌锅，超净工作台，离心机，倒置显微镜，电融合仪。 五.实验步骤实验路线： 纯化的原生质体图示 完整烟草原生质体（40×） PEG法原生质体的融合图示 电融合法原生质体的融合结果 原生质体融合（图1） 电融合法原生质体的融合结果 原生质体融合（图2） 6.原生质体的密度测定 用血细胞记数板记数。每一样品测定3次，根据测定结果，将悬浮原生质体密度调整至5*105个/ml。 7.原生质体的融合 （一）PEG法 1）配制PEG液（5ml） 30%（w/v) PEG(MW=6000) 1.5 g CaCl2.2H2O 0.0074g kH2PO4 0.0005 g 山梨醇 0.0911g  调pH 5.8～6.2 2）将两种原生质体悬液等量混合 3）用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的平皿中，每皿7~8滴，每滴约0.1ml。然后静置10分钟，使原生质体贴在皿底上，形成一薄层（应有3~5个平皿的重复）。 4）用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置10~15分钟。此时可取一个平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。 1、烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体融合（40×） 2、烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体的异源融合 （二）电融合法 1）融合仪参数设置： 成串电流频率0.5MHz,电压30V,成串时间1min,融合脉冲幅宽40μS,融合电压150v,融合槽间距1mm 2）在融合小室中加入约100ul的原生质体悬浮液，将融合小室接好电极后至于倒置显微镜下，静置约3min，使悬浮的原生质体沉降到平板底部，同时打开成串脉冲输出开关及融合脉冲输出开关，使高压脉冲发生电路与融合小室接通。然后轻触脉冲触发开关，施加3次融合脉冲，每次间隔1s。融合脉冲后成串脉冲再保持1min。静置融合小室20～30min，在显微镜下观察融合过程。 原生质体成串（40×） 原生质体融合（图3） Overall aims of research To “capture” disease resistance from wild potato species To use segregating populations to identify plant disease resistance genes and transfer resistance into potato cultivars SOMATIC HYBRIDIZATION IN SOLANUM Somatic hybridization using protoplast fusion Isolate protoplasts (typically leaf mesophyll) from two parental lines Fuse protoplasts either chemically (PEG) or using electrofusion Cell membranes fuse forming one cell containing 2 nuclei On cell division nuclear material condenses together and hybrids cells are for