叶绿素和可溶性糖试验方法步骤.docVIP

试验方法与步骤： 一、叶绿素含量的测定： 将叶片（所有处理都取同一部位）剪碎混匀，每处理称取约0.2g叶片（3次重复）放于研钵，加入少量石英砂及碳酸钙及3ml左右80%的丙酮，研成匀浆，再加10ml 80%的丙酮，继续研磨至组织变白静置3分钟左右，过滤入25ml试管（事先用报纸包裹遮光），用80%的丙酮多次冲洗研钵、研棒、残渣及滤纸，直至无绿色。80%的丙酮定容。80%的丙酮然为空白，取样液于比色杯中在波长663nm、646nm、470nm下测定吸光度。以Lichtenthaler法计算叶绿素含量及类胡萝卜素含量。 Ca=12.21A663-2.81A646 Cb=20.13A646-5.03A663 C=(1000A470-3.27Ca-104Cb)/229= mg/L 求得色素的浓度后，再按下式计算组织中单位鲜重或干重的各色素的含量： 叶绿体色素的含量=（色素的浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重或干重= mg/g 二、酶的粗提取液 A：0.2M NaH2PO4 31.21g NaH2PO4.2H20 定容至 1000ml B：0.2M Na2HPO4 71.64g Na2HPO4.12H20 定容至 1000ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液（PH=7.8）：21.25mlA 加228.75mlB，用水定容至1000ml 选取长势相同的植株，每组处理取叶片0.5g，3次重复，放入预冷的研钵中，先加入1ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液（PH=7.8）及少量石英砂（为了离心时平衡最好提前称取0.2g石英砂20份），冰浴中研磨成匀浆，转移至离心管中，再用4ml上述缓冲液多次冲洗研钵及钵棒，合并入离心管，总体积为5ml ，摇匀后冷藏静置4小时以上，3000r/min离心15min（0～4℃），上清液即为酶的粗提取液，4℃保存。 .可溶性蛋白含量测定，采用考马斯亮蓝G-250染色法测定 a. 考马斯亮蓝G-250溶液的配制：0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%的磷酸100ml并用蒸馏水定容至1000ml；过滤于棕色瓶中保存（最多保存一个月）。 b. 标准曲线的制作 1mg/mL 蛋白标准样：准确配制1mg/mL 白蛋白溶液为标准样，按下表在各管中加样，配制成一系列不同浓度的白蛋白溶液。 管号 管号 管号 管号 管号 管号 0 1 2 3 4 5 标准白蛋白（mL） 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 磷酸缓冲液或蒸馏水（mL） 0.1 （100uL） 0.08 0.06 0.04 0.02 0 考马斯亮兰G250（mL） 3 3 3 3 3 3 蛋白含量（mg） 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 将溶液摇匀后，静置2min。在595nm波长下测其吸光度值，用空白管溶液调零点，以OD值为横坐标，白蛋白量（mg）为纵坐标绘制标准曲线。 c. 可溶性蛋白的测定：100ul酶液＋3ml G250，充分混合均匀后准确放置2min，在595nm波长下比色并记录。同时做空白（100ul磷酸缓冲液＋3ml G250）。比色皿和试管用酒精冲洗（每次都要用少量酒精清洗，再用蒸馏水洗）。 d. 结果计算：样品蛋白质含量（mg/g 鲜重）=（C×V/a）/w C：查标准曲线（参照蛋白标准曲线）所得每管蛋白质含量（mg）； V：提取液总体积（mL） a：测定所取提取液体积（mL） w：取样量（g） （2）.过氧化物酶（POD），采用愈创木酚法测定。 a. POD反应液的配制：0.05mol/L PH7.8的磷酸缓冲液100mL于烧杯中，加入愈创木酚56uL，用磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，待溶液冷却至室温后加入30%H2O2 8uL混合均匀，冷藏保存于冰箱中（0～4℃，且要密封保存）。 b. POD的测定：20uL酶上清液＋3mLPOD反应液加入比色皿中，以不加酶液而加相同体积的磷酸缓冲液为空白对照。在470nm波长下每隔1min比色读数一次共3次；以每min每mg蛋白吸光度变化0.01（△A470/min.g.FW）表示酶活性的大小。 c. 结果计算：POD酶活性=100×（△A470×V）/（a×W×t） V：样液总体积（mL） a：测定时样品体积（mL） W：样品重（g） t：反应时间（min） （3）.过氧化氢酶（CAT）活性测定，采用紫外吸收光测定。 a. （CAT反应液）0.1mol/L的H2O2：5.68mL市售30%H2O2稀释至1000mL 反应液的配制：0.1mol/L的H2O215mL＋0.05mol/L PH7.8的磷酸缓冲液60mL，混合均匀。 b. C