特异乳酸杆菌对人直肠癌裸鼠异种移植瘤细胞增殖影响.docVIP

特异乳酸杆菌对人直肠癌裸鼠异种移植瘤细胞增殖的影响 　　[摘要]目的 探讨特异乳酸杆菌（Lb-f）对人直肠癌裸鼠异种移植瘤模型癌细胞增殖的抑制作用。方法 采用小鼠背部皮下接种人直肠癌系（Colo320）细胞的方法建立裸鼠异种移植瘤模型，并随机分为五组，Ⅰ组作为模型对照组；Ⅱ～Ⅳ组分别以180、360、720 mg/kg的Lb-f灌胃，1次/d，灌胃2周。Ⅴ组腹腔注射化疗剂环磷酰胺100 mg/kg，1次/d，共计2周。利用MTT比色法和台盼蓝计数法测定各组的细胞增殖相对抑制率及生长抑制率，并取肿瘤组织，计算瘤重抑制率以及肿瘤生长抑制率，采用ELISA试剂盒测定Bax、Bcl-2、Caspase-3含量。结果 随着干预时间的延长，Colo 320瘤块体积有明显变化（P 　　[Key words]Colorectal cancer；Nude mice；Xenograft tumor；Lactobacillus fermentum 直肠癌（carcinoma of rectum）是消化道最常见的恶性肿瘤之一，由于位置低，易被直肠指诊及乙状结肠镜诊断[1-3]。本病具有位置深入盆腔、解剖关系复杂、手术不易彻底、术后复发率高等特点和难点，近年来发病率逐年增高，且青年人发病率有升高的趋势。目前，临床主要采用手术、放化疗以及免疫治疗等综合治疗手段进行治疗，常用的化疗药物存在选择性低、疗效欠佳、毒性较大和易产生耐药性等缺点[4-5]，因此寻找选择性较高、对正常细胞毒性较低的药物已经成为新的发展方向。特异乳酸杆菌（Lactobacillus fermentum，Lb-f）是乳酸杆菌中的一种，有文献表明其对机体有免疫调节作用，这可能与其治疗某些疾病存在相关性，而且Lb-f对人结肠癌存在抑制功能。本研究根据人直肠癌裸鼠异种移植瘤模型治疗实验对Lb-f抗人直肠癌的作用进行评价，得到了一些有效数据和结论 1材料与方法 1.1材料 体外培养人直肠癌细胞系Colo320细胞，人直肠癌异种移植瘤突变系BALB/c-nu雌性裸小鼠120只 1.2方法 1.2.1造模和分组 实验模型：①体外培养人直肠癌细胞系Colo320细胞，用含小牛血清的RPMI-1640培养液37℃恒温培养，CO2浓度5%；当细胞涨势良好，铺满整个瓶壁后，胰蛋白酶消化，进行传代培养，对数生长期用于实验。②调整Colo320细胞浓度1×107/ml，接种于小鼠背部皮下，游标卡尺测量瘤体长、短径，计算初始体积 1.2.2细胞增殖抑制率和细胞生长抑制率 1.2.2.1体外实验 按1×103/孔接种于96孔板中，采用MTT比色法测定细胞增殖相对抑制率（IR%），IR%=（1-实验组A均值/对照组A均值）×100%，其中A为吸光度；采用台盼蓝活细胞计数法测定细胞生长抑制率。体外实验分组如下：调零组（不加MTT）；空白对照组（等量PBS液）；溶媒对照组（0.2% DMSO）；阳性药物对照组（CTX 20 μg/ml）；Lb-f 30组（30 μmol/L）；Lb-f 60组（60 μmol/L）；Lb-f 90组（90 μmol/L）；每组10孔，作用48 h后进行指标测定 1.2.2.2在体实验 剔除接种不成功者及体重过小或过大者，纳入100只小鼠进行实验研究，根据体重将其随机分为5组，每组20只。Ⅰ组：荷瘤BALB/c-nu对照组（NS 0.1 ml/10 g）；生理盐水灌胃，与Ⅱ～Ⅳ组同步。Ⅱ～Ⅳ组：Lb-f实验组（Lb-f 180、360、720 mg/kg）；用生理盐水分别配置180、360、720 mg/kg的Lb-f溶液进行灌胃，每天晨8时，灌胃2周。Ⅴ组：化疗剂环磷酰胺阳性药对照组（CTX）；腹腔注射100 mg/kg，1次/d，共计2周。末次给药或灌胃24 h后脱颈椎处死小鼠，观察瘤体积和瘤重，计算瘤重抑制率和肿瘤生长抑制率。瘤体积：V=L×W2×0.52；瘤重抑制率（%）=（1-实验组瘤重均值/对照组瘤重均值）×100%；肿瘤生长抑制率（%）=（1-实验组瘤体积均值/对照组瘤体积均值）×100% 1.2.3细胞增殖的生物学指标 Ⅰ～Ⅴ组取出的瘤体组织，加入9倍重量的生理盐水，电动匀浆器匀浆，配置为10%的匀浆液，以ELISA试剂盒和全自动生化分析仪测定B细胞淋巴瘤因子相关x蛋白（Bax）、细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的含量。ELISA试剂盒均由上海拜力生物科技有限公司提供 1.3统计学处理 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计量资料以x±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P 　　直肠癌位置深入到患者盆腔，解剖关系较为复杂，手术难以