细胞融合及制备单抗的具体方法.docVIP

细胞融合及制备单抗的具体方法 一、小鼠及免疫方法 取6～8周龄BALB/c小鼠腹腔注射完全佐剂加抗原液0.1ml，2～4周后，腹腔再注射不完全佐剂加抗原液0.1ml。2周后由小鼠眼眶用毛细管取血，测血清中特异性抗体的滴度。高滴度小鼠2周后由静脉或腹腔注射纯抗原液，3日后取脾作融合。可溶性抗原在第三次免疫时，连续4～5日每日由尾静脉注入纯抗原0.1～0.2ml。抗原量由小到大。最后一次注射后，次日取脾作融合。抗原用量，如为纯抗原，可用50～100μg。如为混合抗原，可估计其中含所需抗原的含量，加大抗原用量。 二、收集小鼠腹腔巨噬细胞 将正常BALB/c小鼠拉颈处死，70%酒精浸湿腹部的前后。用剪在小鼠腹部皮肤剪一横口，用两手在横切口两侧用力撕开腹部皮肤，暴露去皮的腹部，用镊提起肌肉及腹膜，再用10ml注射器将5ml枸橼酸PBS注入小鼠腹腔中，用左手手指轻轻按摩腹部约1～2分钟，立即用原注射器将注入的液体吸回，并注于玻璃或塑料试管中，将试管在1000r/min离心10分钟，去上清，加适量的HAT培养基，使细胞浓度为5×105/ml，用吸管冲洗混匀后分注于96孔培养板中，每孔0.1ml。将培养板放在37℃CO2孵箱中孵育。取腹腔细胞可在融合前一天或当天进行。 三、免疫小鼠的脾细胞 免疫后的小鼠，拉眼球放血至死，血液凝集后收血清备用。死鼠按上述2项的方法，暴露腹部，剪开腹膜取脾。由于曾注射过福氏完全佐剂，有时脾周围有粘连，取脾时要注意勿剪破肠道。取出的脾，放入5ml无血清的RPMI1640培养基中，在平皿上，用注射器的柄将脾压过不锈钢丝网，即得脾细胞液，将脾细胞液移入试管，直立静置5分钟使大块下沉，吸出上部混悬液，1000r/min离心10分钟，去上清，加10ml无血清培养基混匀，取一滴加定量伊文氏蓝或台盼蓝液，计算活细胞数。 四、细胞融合 (一)将(2～5)×107个小鼠脾细胞与107个骨髓瘤细胞混合于50ml离心管中，1000r/min离心10分钟。 (二)倾去上清，用吸管将管口的上清完全吸去。加0.1ml无血清培养基，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水浴中。 (三)将在37℃水浴中保温的50%PEG0.5ml，用滴管缓慢地先慢后快地滴入离心管中，在一分钟内滴完，在37℃水浴中边滴边摇动离心管，使细胞保持混匀状态。 (四)加完PEG后，将细胞悬液放在37℃水浴中静置60秒钟，立即在2分钟内加入15ml无血清的RPMI1640(37℃)，开始要一滴一滴加。由于RPMI1640的稀释使PEG停止作用。注意尽可能不搅动细胞。 (五)1000r/min离心7分钟，去上清。加25mlHAT培养基，轻轻混匀。将混悬液分装入已有巨噬细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml。 (六)培养板在含有水蒸气的CO2孵箱37℃孵育。CO2含量为5～7%。 (七)每3天换一次HAT培基，连续10天。10天后可改用HT培养基。 五、培养上清中特异性抗体的检测 当培养孔中的杂交瘤群落扩增到孔面积的1/2以上时，就要进行特异性抗体的检测。抗原如为组织、细胞、寄生虫、真菌或细菌时，可用切片或涂片作间接免疫荧光法检测有无特异性抗体及其滴度。如为可溶性抗原，可使用斑点-ELISA或板-ELISA法检测。如抗体量极少，条件可能时也可用同位素法。阳性孔在下次换培养基时，再测1～2次以排除假阳性。多次阳性孔即可扩大培养或液氮保存。由于融合后形成的杂交瘤阳性率较高，故所用检测方法需要敏感、快速、简便，可以在短时间内筛选大量抗体。阳性孔的杂交瘤要尽早进行克隆。 六、克隆(单个细胞培养) 常用的是有限稀释法，具体方法如下： (一)取同系小鼠腹腔细胞(方法如2)，去上清，加5mlHT培养基混匀。 (二)取96孔培养板，每孔加小鼠腹腔细胞悬液0.05ml(Kohleretal，1975)。 (三)取杂交瘤培养0.25ml加HT培养基0.5ml混匀，取0.25ml加伊文氏蓝，在血细胞计数板上计算活细胞总数。 (四)将剩下的0.5ml杂交瘤细胞液按活细胞总数用HT培养基稀释为10个细胞/ml。如总数为40×104/ml，则用下法连续稀释： 0.5ml40×104/ml液+1.5mlHT培养基→10×104/ml。 取0.1ml的10×104/ml液+9.9mlHT培养基→10×102/ml。 再取0.1ml的10×102/ml液+9.9mlHT培养基→10/ml。 (五)将10个细胞/ml的杂交瘤液用吸管放入96孔培养板中(已放入小鼠腹腔细胞液)，每孔0.1ml。