第三章 基因工程制药567节课件1.pptVIP

2、连续培养 将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定的稀释率进行不间断的培养。 3、透析培养 利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。 传统生产外源蛋白的发酵方法，由于乙酸等代谢副产物的过高积累而限制工程菌的生长及外源基因的表达，而透析培养解决了上述问题。 4、固定化培养 有利于提高质粒的稳定性，便于进行连续培养，特别是对于分泌型菌更为有利。 二、基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同,基因工程菌带外源基因,发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。 工艺要求： 外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。 影响发酵的主要因素： ⒈ 培养基成分的影响 ⒉ 接种量的影响 ⒊ 温度的影响 ⒋ 溶解氧的影响 ⒌ 诱导时机的影响 ⒍ pH的影响 ⒈ 培养基的影响 　 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。还有无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。 不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但以甘油为碳源的菌体收获量较大，而以葡萄糖为碳源的菌体产生的副产品较多。葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。使用乳糖为碳源较为有利，乳糖对lac启动子起诱导作用。 在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对trp启动子控制的基因有影响。 无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。 在生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的合成、糖代谢、细胞呼吸及ATP浓度的控制中，过量的无机磷会刺激葡萄糖的利用、菌体生长和氧消耗。研究表明，在低磷浓度下，尽管最大菌体浓度较低，但产物产率及产物浓度都最高。 启动子只有在低磷酸盐时才被启动，因此必须控制磷酸盐的浓度，使细菌生长到一定密度，磷酸盐被消耗至低浓度时，目的蛋白才被表达。 起始磷酸盐浓度应控制在0.015mol／L左右，浓度低影响细菌生长，浓度高则外源基因不表达。 ⒉接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。 接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。 接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。 5%、10%、15%？？？？ ⒊ 温度的影响 温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节物质的合成等水平上。 温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。 如大肠杆菌合成青霉素酰化酶不仅受苯乙酸诱导和葡萄糖阻遏，而且还受温度的调控。青霉素酰化酶基因工程菌-大肠杆菌A56 (pPA22)，合成青霉素酰化酶的量从37℃起随着温度降低而逐渐增加，至20-22℃达到高峰，在18℃和16℃合成酶量又逐渐下降，这是由于在18℃和16℃培养时菌体生长较慢，影响所合成酶的总量。 适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。 温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。 温度高(37℃)时，由于细菌的热体克(hot-skock)系统被激活，大量的蛋白酶被诱导，使表达产物降解。因此，表达量低于在30℃时发酵的产量。 重组人生长激素在不同的温度培养时，还影响产物的表达形式：30℃培养时是可溶的，在37℃培养时则形成包含体。 ⒋ 溶解氧的影响 对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。 若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随dO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的dO2值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法, 可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。 ⒌ 诱导时机的影响