第二章_生物制品的制备课件1.pptVIP

2）亲和层析有如下特点（Characteristics of Affinity Chromatography） 纯化过程简单、迅速； 分离效率高； 产物纯度高； 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件。 因此应用范围受到一定的限制。 8）载体、配基、目的物的连接（Conjunction of vector、ligand and target material） 载体（Vectors or Matrix） + 配基（Ligand） + 目的物（target material） Fig AC relies upon a reversible highly  specific binding reaction. Fig Spacer arm principle Fig Principle of preparing AC media 9）亲和层析的基本操作方法： ①平衡（ Equilibration） 用平衡Buffer冲洗柱体，至基线平稳. pBR322质粒来源：pSF2124质粒的氨卞青霉素抗性基因（Apr）；pSC101质粒的四环素抗性基因（Tcr）；ColEⅠ的派生质粒的复制起点（ori）。在Apr基因中有一个PstⅠ切点， Tcr基因中有一个BamHⅠ和一个SalⅠ切点。 化学合成目的基因 利用磷酸二酯法、磷酸三酯法等方法合成。化学合成的先决条件是必须要知道DNA的碱基顺序。此法一般只能合成较短的多肽激素基因。世界上第一个人工化学合成并表达的基因是生长素释放抑制素基因。 在获取目的基因后，应首先考虑所得基因是否是所需要的目的基因。 凝胶电泳及酶切图谱测定 核酸杂交 DNA序列测定 （3）目的基因的鉴定 常用的载体有：细菌质粒 质粒是一些细菌的亚细胞结构，是存在于多种细菌染色体外的遗传单位。是一类双链、闭环的DNA分子，分子量约1-200kb。质粒DNA分子可以游离存在于染色体外，在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂遗传给后代。作为载体，质粒可以接纳中等大小的DNA片断，如小于10kb的DNA；如果大于10kb的DNA插入质粒，将大大降低重组质粒的转化率和产量。 2、重组载体的选择与制备 pBR322 Apr Tcr Ori PstⅠ BamHⅠ SalⅠ ③洗脱（Elution） 选择适当的条件，将吸附在亲和介质上的目的物解吸下来（见下图）。 四、核酸类制品的分离纯化方法 （Isolation and depuration of nucleic acid ） 核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法。提取法生产DNA和RNA，先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离RNA与DNA。发酵法主要用于生产单核苷酸。 高RNA含量酵母 摇瓶发酵 种子培养物 连续发酵 发酵液 过滤 酵母菌体 NaOH 20℃搅拌 破壁 氨水处理 离心 上清液 沉淀蛋白 三氯乙酸 酸调pH 核酸粗品 乙醇洗涤 干燥 RNA干品 五、糖类制品的分离纯化方法 （ Isolation and depuration of sugar ） 由于各种糖类制品的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化方法。 （1）提取方法 （extraction） 非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。 降解法（degradation）适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖（mucoitin）。如从软骨中分离提取硫酸软骨素（chondroitin sulfate），就是用碱处理进行降解。又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。 （2）分离方法 （isolation） 常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。 乙醇沉淀法（alcohol precipitation）：是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级分离。4-5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵（CTA）等。 离子交换层析法（ion exchange chromatagraphy)：粘多糖的聚阴离子能够很好地被阴离子交换剂吸附和分离，如Dowex I-X2（商品名）离子交换树脂、DEAE-离子交换纤维素（二乙胺乙基）等。洗脱可用NaC1溶液进行梯度洗脱。 六、脂类制品的分离纯化方法 （isolation and dep