Th17细胞在小鼠H22原位肝癌模型中的效果观察分析.docVIP

Th17细胞在小鼠H22原位肝癌模型中的效果观察分析 肝细胞癌（hepatocellutar?carcinoma，HCC）是世界上最多见的五大恶性肿瘤之一，死亡率列前三位[1]，我国是HCC多发国家。但目前以手术为主的综合治疗方法疗效仍不理想，故近年来免疫治疗越来越受到重视。　　Th17细胞是一种以分泌IL-17为主要特征的CD4+T细胞，孤核受体RORγT是其特异的转录因子。Th17细胞首先是在EAE和CIA的研究?中被发现，现研究表明IL-17的表达和人类很多自身免疫性疾病有关，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎症性肠病等[2-4]。最近研究发现，在一些肿瘤患者或小鼠肿瘤模型的肿瘤标本中Th17细胞明显升高，但是关于Thl7和HCC的研究，国内鲜有见到相关的报道。故本研究通过建立Balb/C小鼠原位荷瘤模型，检测脾脏中Th17细胞的比例、肿瘤微环境中IL-17基因和RORγT基因的表达，为能进一步系统地研究Th17细胞在肝癌免疫中的作用和机制打下良好的基础。　　1?材料与方法　　1.1材料　　1.1.1动物：6～8周龄SPF级雄性Balb/C小鼠，体重（20±2）g。30只小鼠随机分为肝癌模型组、生理盐水对照组、空白对照组，各10只进行实验。　　1.1.2肿瘤细胞株?鼠源性H22腹水型肝癌细胞株。　　1.1.3抗体和试剂?FITC?Rat?Anti-Mouse?CD4、PE?Rat?Anti-Mouse?IL-17A购自美国BD公司；SYBR?Green?Supermix?购自美国Bio-rad，PCR引物由上海浦生生物科技有限公司合成。　　1.2方法　　1.2.1?小鼠原位肝癌模型的建立?H22肝癌细胞注入Balb/C小鼠腹腔，后抽取癌性腹水调整细胞浓度备用。肝癌模型组：小鼠麻醉后，开腹直视下将0.01?mL癌细胞悬液注入肝脏。生理盐水对照组：肝内注入0.01?mL生理盐水。模型制作后第30天处死小鼠取肝脏肿瘤组织固定，常规HE染色，?进行病理组织学诊断。　　1.2.2?Th17细胞流式检测?①取肝癌模型组、生理盐水对照组、空白对照组脾脏，机械法分离细胞，红细胞裂解液去除红细胞。②获得的各组脾脏单个核细胞按照免疫磁珠操作规程分选?CD4+T细胞。③CD4+T细胞接种于24孔培养板，加入PMA，Ionomycin，Monensin，使其终浓度分别为125?ng/mL，1?μg/mL?和1。6?μg/mL，在37℃、5%二氧化碳的环境下培养4h。④取细胞悬液，先后加入CD3-PE-CY5，FITC?Rat?anti-mouse?CD4标记细胞表面抗原，PE?Rat?Anti-Mouse?IL-17A胞内染色，设同型对照组。用FACS?Calibur流式细胞仪检测，以CD4，IL-17A双阳性细胞占CD4+T细胞的百分比记录结果。　　1.2.3?实时荧光定量PCR检测?Trizol法提取各组总RNA，反转录合成cDNA。由SYBR?Green?Supermix，forward?primer，reverse?primer，cDNA等试剂建立一个10?μL?的反应体系（引物设计见表1），放入ABI高通量荧光定量PCR仪7900HT进行反应，反应条件：开始50℃?2?min?，95°C?10?min，接着95°C?15?s?和?60°C?1?min共45个循环。最后根据待测基因和内参的循环数CT值，使用2?-△△CT方法进行相对定量结果分析。　　1.3统计学方法　　采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较均采用单因素方差分析，P??0.05为差异有统计学意义。　　2?结果　　2.1小鼠原位肝癌模型建立　　病理检查示肝癌组织正常肝小叶结构消失，瘤细胞异型性明显，大小、形态不一，核大、深染，肿瘤细胞排列紧密，?与周围的肝组织分界较为明显，肿瘤组织坏死明显（图1）。　　2.2流式检测Th17细胞的相对比例　　肝癌模型组脾脏Th17细胞占CD4+T细胞的比例（1.79±0.45）%高于空白对照组脾脏（0.17±0.17）%和生理盐水对照组脾脏?（0.20±0.09）%，差异有统计学意义（P??0.01），而空白对照组脾脏、生理盐水对照组脾脏之间Th17细胞占CD4+T细胞的比例差异无统计学意义（P??0.05），见表2和图2。　　2.3?IL-17基因和RORγT基因表达检测结果　2.3.1?肝癌模型组肿瘤组?织IL-17mRNA的表达?其水平（3.70±0.43）高于空白对照组肝脏组织（0.79±0.13），生理盐水对照组肝脏组织（0.84±0.39）和肝癌模型组癌旁远端组织?（0.70±0.27），差异有统计学意义（P??0.01），而各对