CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞.docVIP

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2017-05-28 发布于重庆
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CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞.doc

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CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

CaCl2法制备感受态细胞转化(Transformation)将外源DNA分子引入受体使之获得新的遗传性状。受体一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代受体细胞经过一些特殊方法如电击CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性成为感受态细胞(Compenent cells)外源DNA分子进入目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbClKCl法，RbClKCl法制备的感受态细胞转化效率较高但CaCl2 法简便易行且其转化效率完全可以满足一般实验的要求制备出的感受态细胞暂时不用时可加入无菌甘油总体积15％于-70℃保存半年因此CaCl2法为使用更广泛。0.05mol/L CaCl2-15%甘油溶液CaCl2必须为分析纯以上。实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净，高温高压灭菌；注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。受体菌的培养从LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中37℃振荡培养至对数生长后期。将该菌悬液以1:100的比例接种于0~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2小时至OD6000.5。培养液冰分钟后4℃5000g离心分钟。4℃8000g离心分钟用预冷的4℃5000g离心分钟。加入ml预冷0.05mol/L CaCl2-15%甘油溶液轻冰分钟4℃5000g离心分钟。加入ml预冷0.05mol/L CaCl2-15%甘油溶液轻即成感受态细胞悬液。分装成00μl的小份贮存于-70℃可保存半年。μl/管。说明：我本人在对比了数种CaCl2法制备感受态细胞