第四专题dna重组与基因工程.pptVIP

目 录 第一节 基因重组 第二节 基因工程 第一节 基因重组 一、同源重组 二、细菌的基因转移与重组 三、位点特异重组 四、转座重组 Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤： ①两个同源染色体DNA排列整齐； ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体； ③通过分支移动产生异源双链DNA； ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： （一）目的基因的制备 （1）化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 （2）基因组DNA文库(genomic DNA library) （3）cDNA文库(cDNA library) （4）聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 左下角处有超级链接到配伍末端 3）常用的DNA限制性内切酶的专一性 酶 辨认的序列和切口 说明 Alu I ‥ ‥A G C T ‥‥ ‥ ‥T C G A ‥ ‥ 四核苷酸，平端切口 Bam H I ‥ ‥G G A T C C ‥‥ ‥ ‥C C T A G G ‥‥ 六核苷酸，粘端切口 Bgl I ‥ ‥A G A T C T ‥‥ ‥ ‥T C T A G A ‥‥ 六核苷酸，粘端切口 Eco R I ‥ ‥G A A T T C ‥‥ ‥ ‥C T T A A G ‥‥ 六核苷酸，粘端切口 Hind Ⅲ ‥ ‥A A G C T T‥‥ ‥ ‥T T C G A A ‥‥ 六核苷酸，粘端切口 Sal I ‥ ‥G T C G A C ‥‥ ‥ ‥C A G C T G ‥‥ 六核苷酸，粘端切口 Sma I ‥ ‥C C C G G G ‥‥ ‥ ‥G G G C C C ‥‥ 六核苷酸，平端切口 限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的DNA分子。 4）限制性内切酶的意义 （1）粘性末端连接 方式：1)同一限制酶切位点连接 2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 2、连接方式 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 (2)平端连接 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 (3)同聚物加尾连接 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 (4)人工接头(linker)连接 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ （四）重组体导入受体菌 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) （五）重组体的筛选 （1）直接选择法 1) 抗药性标记选择 2) 标志补救(marker rescue) 3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 （2）免疫