第十六章基因工程及其在医学中的应用.pptVIP

第 一 节 基因工程 基因工程操作流程 ①载体的构建和选择； ②目的基因的制备； ③限制性内切酶酶切载体和目的基因形成相匹配的接口； ④DNA连接酶连接载体和目的基因； ⑤重组DNA转化入细胞； ⑥扩增； ⑦筛选和鉴定重组子； ⑧表达，纯化蛋白 基因工程载体的一般要求 ①能够自我复制，产生大量拷贝，装载目的基因后使后者能得到大量扩增； ②载体DNA在提纯分离中容易和宿主细胞的染色体DNA分开； ③本身分子量较小，容易操作，可装载较大分子量的目的基因； ④具有多个单一限制性内切酶酶切位点，便于目的基因的插入； ⑤含有一个或多个筛选标记，目的基因插入、转化细菌后可以通过抗生素抗性、营养缺陷或显色表型反应等进行筛选； ⑥稳定地在子代细胞中复制或表达。 载体分类 按载体来源分为: 质粒 噬菌体 病毒 按载体用途分为: 克隆载体 表达载体 按载体的宿主细胞分为: 原核克隆/表达载体 真核克隆/表达载体 pUC18/19 目的基因的获取 人工合成 基因文库 cDNA文库 PCR扩增 人工合成 人工合成基因的局限性 长度有限 密码子兼并性 二级结构影响拼接 费用较高 应用核酸的分离纯化技术，直接从生物体组织和细胞中将全部DNA提取出来，然后用限制性内切酶随机地将DNA酶切成20kb~40kb或更大的数以万计的片段。将所有的片段与同一类载体连接重组，得到数以万计的重组体，再全部转化入宿主细胞进行扩增和保存。这种含有所有DNA克隆的混合体就是基因文库。 需要制备目的基因时，可以通过探针或其他技术将所需的目的基因从基因文库中“钓”出来。 PCR基本原理 PCR反应体系 模板（template） 引物(primer) DNA 聚合酶(DNA polymerase) dNTP PCR buffer PCR 热循环 94℃, 300S 94℃, 60S 30 55℃, 60S 72℃, 60S 重组DNA分子引入受体细胞 转化 转染 感染 二、转染 指病毒或以它为载体构建的重组子（非包装形式）导入受体细胞的过程。 二氢叶酸还原酶(DHFR)基因缺陷 α 互补筛选 目的基因的表达 原核基因表达体系 真核基因表达体系 原核表达载体 强启动子 强终止子 启动子必须受控制 起始密码子与SD序列有合适距离 蛋白选择标记 具复制原点、多克隆位点 原核细胞重组蛋白的表达、分离和纯化 真核表达体系 优点： 转录后加工 翻译后加工 缺点： 操作麻烦 费用较高 重组DNA进入真核细胞的方法 转染 DNA-磷酸钙转染法 DEAE-葡聚糖转染法 阳性脂质体转染 电穿孔法 显微注射法 病毒感染法 常用的分子生物学技术 核酸杂交 测序 转基因技术与核移植技术 基因敲除技术和RNA干扰技术 核酸杂交 杂交方法 Southern blot：检测DNA Northern blot：检测RNA Western blot：检测Protein dot blot gene chip Gene Chip 测序 双脱氧链终止法 化学裂解法 自动测序 转基因技术 核移植技术 个体克隆：将动物早期胚胎细胞或体细胞的细胞核移植到去核受精卵或成熟卵母细胞中，重新构建新的胚胎，发育成供核细胞基因型完全相同后代的个体。 基因敲除技术 利用同源重组技术，人为地敲除某种基因。 用途： 基因敲除动物模型 研究基因功能 RNA干扰技术 RNAi的应用 基因治疗 基因功能研究 基因工程在医学中的应用 基因诊断 基因治疗 生物制药 复习 名词解释 Gene engineering vector transformation PCR Hybridization Southern/Northern/Western blot 问答 基因工程载体必须具备哪些条件？ 试述基因工程的一般原理。 分离目的基因的方法有哪些？ 重组子筛选鉴定的方法有哪些？ α 互补筛选的原理是什么？ 分子生物学技术在医学中的应用 双脱氧链终止法 基于多种荧光染料标记的自动化测序系统 DNA连接酶 1、大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端 2、T4DNA连接酶：既能连接粘性末端，又能连接平末端