慢病毒感染细胞筛选稳定细胞株方法.PDF

慢病毒感染细胞筛选稳定细胞株方法 A、嘌呤霉素最优浓度筛选 每种细胞对抗生素的敏感性不同 ，因此 ，准备建立稳定细胞株之前 ，确定杀死未转染/感染 细胞的最低浓度嘌呤霉素 （puromycin ）至关重要。所以初次做实验的客户一定要建立适 合自己体系的 puromycin 抗生素最优浓度。 （1 ）24 孔板内以 5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验 ， 细胞 5%CO 培养箱孵育过夜。 2 （2 ）准备筛选培养基：含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如 0-15μg/mL ，至少5 个梯 度）（通常范围为 2-10 µg/ml ）。 （3 ）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞。 （4 ）约2-3 天更换新鲜的筛选培养基。 （5 ）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4 天之间。 （6 ）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4 天内杀死所有细胞的最低筛选浓 度。 B、慢病毒感染细胞和稳定细胞系筛选 （1 ）day 0 ：24 孔板内以 5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，5%CO2 培养箱孵育过夜。 （2 ）day 1 ：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI 的病毒颗粒；（病毒感染时 细胞密度为 30%-40% ） 3 加药量计算方法： （细胞数×MOI 值/病毒原液滴度）×10 =病毒加药量（μl ），培养基的 总量必须充分覆盖住细胞。 加 polybrene ：Polybrene 是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的 作用。Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为 2-10 µg/ml ）。过长时间暴露于 Polybrene （ 12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。 （3 ）病毒感染细胞后 8-12h ，弃去培养基后每孔加入 500μl 新鲜的完全培养基。5%CO2 培养箱培养。 （4 ）病毒感染细胞后 72h ，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基，继续培养、传 代扩增。（根据细胞密度考虑是否传代） （5 ）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基。 （6 ）约每2-3 天替换新鲜配制的筛选培养基。 （7 ）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及GFP 等表达的水平及所占比例。在某一个 时间点几乎所用存活细胞都可以表达 GFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在 3-10 天之间。