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固定化微生物原理及方法 所谓固定化技术(IMC)，就是利用化学的或物理的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使之成为不悬浮于水仍保持生物活性，可反复利用的方法。包括固定化酶技术和同定化细胞技术，微生物被固定后，细胞内酶系统保存完整，相当于一个多酶生物反应器，与传 统的悬浮生物处理法相比，它具有处理效率高、稳定性强、反应易于控制、菌种高纯高效、生物浓度高、污泥量少、固液分离效果好、丧失活性可恢复等优。其固定方法国内外没有统一的分类标准，根据对各种方法的分析，可将其分为物理固定法和化学固定法两大类。物理同定法主要有吸附法、包埋法、截留法，化学固定法包括共价结合法和交联法 1.1吸附法 吸附法是依据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和黏附力的作用，而使微生物细胞固定在载体表面和内部形成生物膜的方法。这是一种非常廉价、有效且常用的微生物固定化方法。吸附法可分为物理吸附和离子吸附。物理吸附是使用具有高吸附能力的物质，如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、卵石、焦炭、硅藻土、多孔砖等吸附剂，将微生物吸附在表面使其固定化。离子吸附是利用微生物在解离状态下离子健合作用而固定定于带有相反电荷的离子交换剂上，常见的离子交换剂有DEAE一纤维素、CM一纤维素等。吸附法操作简单，微生物固定过程对细胞活性的影响小，但所固定的微生物数量受所用载体的种类及其表面积的限制。 固定化对于吸附载体的要求包括：具有抗物理降解、抗化学降解、抗生物降解的稳定性，具有一定的机械强度和结构稳定性。根据载体性质可分为：有机载体和无机载体，有机载体又分为天然载体和合成载体。天然载体包括：聚多糖，如纤维素、葡萄糖；蛋白质，如明胶、胶原蛋白；碳材料，如无烟煤、木材等。合成载体包括：乙烯和马来酸酐的共聚物、戊二醛缩水甲基丙烯酯共聚物、合成的离子交换材料及塑料等。无机载体主要包括：玻璃、陶瓷、含水的金属氧化物及硅藻土等。 Fig.1不同载体活性对比 吸附载体聚氨酯泡沫木屑大孔树脂多空陶粒固定化细胞相对活性40.2%37.6%20.8%32.1%固定化细胞相对活性=（固定化细胞活性/游离细胞活性）*100% 造成活性差异原因：各种载体的吸附容量不同，因而所固定的细胞量不同，有些吸附载体对微生物细胞可能有毒害作用，各种载体与微生物细胞之间的结合程度不一样，有些易脱落 优点：吸附法操作简单，微生物固定过程对细胞活性的影响小， 缺点：所固定的微生物数量受所用载体的种类及其表面积的限制，不够牢固易脱落。 1.2包埋法 包埋法是使微生物细胞包埋在半透明的聚合物或膜内，或使微生物细胞扩散进入多孔性的载体内部，小分子底物及反应代谢产物可自由出入这些多孔或凝胶膜，而微生物却不能动。在溶液中改变一个或者多个参数，如，改变温度、盐度、PH值或者溶剂，一些天然或者合成高聚分子聚合物，通过沉淀作用形成凝胶。 固定化微生物细胞的实用化对包埋载体的要求包括：固定化过程简单，易于制成各种形状，能在常温常压下固定化;成本低;固定化过程中及固定化后对微生物无毒；基质通透性好；固定化细胞密度大；载体内细胞渗漏出少，外面的细胞难以进入；物理强度和化学稳定性好；抗微生物分解；沉降分离性好。 包埋材料可分为：天然高分子多糖类和合成高分子化合物两大类。 天然高分子：海藻酸钠、卡拉胶、角又菜胶、壳聚糖和琼脂，它们具有固化成型方便，对微生物毒性小及固定化密度高等有点。但它们抗微生物分解性能较差，机械强度较低。合成高分子化合物：常用的载体物质有聚丙烯酰胺、光硬化树脂、聚乙烯醇 PVA、聚丙烯胺 ACAM、聚乙烯乙二醇 PEG、聚碳酸乙烯酯（PVCA），甲基丙烯酸类等。它们的突出有点是抗微生物分解性能好，机械强度高，化学性能稳定。但聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞损害较大，而且形成多样性和控制性不好 这种同定化方法操作简单，制作的同定化微球的强度高、能保持多酶系统、对微生物细胞活性影响较小；制备成本高，载体无法再生，传质阻力大，严重影响了微生物的生长和产物的代谢。 1.3共价结合法 共价结合法是细胞表面上功能团(如氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑基等)和 固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。该方法固定化微生物稳定性好，不易脱落。但限制了微生物的活性，反应条件激烈，操作与控制复杂。有研究者使用此法固定卡尔酵母(Saccharomycesluteus)于已活化的多孔玻璃上，虽然细胞已经死亡，但仍然保留生产尿酐酸的活性。 1.4交联法 交联法，是一种无载体固定法，通过物理或者化学手段，使酶和微生物细胞之间彼此附着固定。交联法可分为： 1）化学交联，是通过微生物与具有两个或两个以上官能基团的试剂反应，使微生物菌体相互连接成网状结构而达到固定化微生物的目的。为常见的交联剂是戊二醛、