实验十六细胞核与线粒体的分级分离.pptVIP

实验十六 细胞核与线粒体的分级分离 (选做，综合性实验，8学时） 实验原理 细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。 实验原理 分级分离（Fractionation）由低速到高速离心逐渐沉降，先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清夜中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核，线粒体等得以分离。 细胞核的分离提取 步骤：小白鼠肝脏（用生理盐水洗涤） 将湿重1g的肝组织放于培养皿中，加入8ml 预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液剪碎肝组织 倒入匀浆器中（冰浴）研磨，过滤，涂片，做好标记，自然干燥。 用1%甲苯胺兰染色观察.(1) 接上步 滤液以2500rpm离心15min,上清夜涂片(2)干燥。用1%甲苯胺兰染色观察 余下沉淀用6ml 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液悬浮沉淀物,以2500rpm离心15min,弃上清液 将沉淀配制成悬液,涂片,（3）干燥。用1%甲苯胺兰染色观察 结果 （1）（2）（3）用1%甲苯胺兰染色后盖片即可观察。 高速离心分离提取线粒体 上清液分离线粒体用。以17000rpm离心20min，弃上清液，留沉淀。 加入0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液1ml，以以17000rpm离心20min，沉淀物加入0.1ml 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液,制成悬液. 取上清液和悬液,分别滴片,各滴一滴0.02%詹纳斯绿B染色20min. 实验结果 油镜下观察,颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色. 思考题 * *