实验二、逆转录、RT-PCR.pptVIP

实验 二、逆转录、RT-PCR 一、实验目的 学习和掌握逆转录、RT-PCR基因扩增技术和操作方法，，并深刻理解逆转录、RT-PCR基因扩增技术在功能基因克隆与载体构建过程中的重要性。 二、实验试剂及材料 大肠杆菌DH5a、Trizol试剂、逆转录试剂、PCR相关试剂、PCR产物克隆试剂、氯仿、异丙醇、DEPC水等。 三、实验器材 恒温水浴锅、PCR仪、台式低温离心机、移液枪、恒温培养箱、电泳仪、研钵、紫外分光光度计，一次性手套移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)。 四、实验原理 ◆PCR(polymerase chain reaction)即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。 ◆三个过程 变性:通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解 离形成单链DNA 。 退火:当温度突然降低时，反应体系中引物和其 互补的DNA模板在局部形成杂交链。 延伸:在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸（dATP,dCTP, dGTP,dTTP）及Mg2+存在条件下, 聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应 PCR的反应原理 ◆PCR反应体系 上下游引物(10-50pmol) 缓冲液(pH 8.3) Mg2+(0.5-2.5mM) dNTPs (0.2mM) Taq DNA聚合酶(2.5U) DNA模板(1ng) ◆PCR循环的主要参数 预变性：92℃-95℃， 2-5min 变 性：92℃-95℃，30s-1min 复 性：40℃-60℃，20s--2min 延 伸：70℃-75℃，30s--3min 循 环：30-40次 总延伸：72℃，7min ◆ PCR技术的特点 高度敏感性 高度特异性 操作简便 适用广泛 引物设计原则 ◆长度在15-30bp，GC含量在45-55%之间。 Tm=4(G+C)+2(A+T) ◆ 3’不能与引物内部互补，以免形成二级结构 ◆两个引物各自的3’不能互补,以免形成自身扩增。 ◆引物必须经GenBank查询后，证实没有与其他非目 的DNA有高度互补，才能使用。 ◆ PCR的主要用途 目的基因的克隆： 利用特异性引物； 利用简并引物 基因的体外突变 采用随意设计的引物,在体外对基因进 行嵌合、缺失、点突变等改造 基因表达分析 DNA的微量分析检测 个人识别 亲子鉴定 PCR 逆转录PCR(RT-PCR) mRNA cDNA第一链 Oligo（dT）12－18, 逆转录酶 特异性引物, Taq酶 用途: 获得所需cDNA片段；检测基因表达 AAAAAAAAA 5’ 3’ RNA First Strand Synthesis NMTTTTTTTTT 5’ Oligo dT primer AAAAAAAAA 5’ 3’ RNA NMTTTTTTTTT 5’ cDNA First Strand Synthesis Reverse transcriptase 四、实验步骤 1、RNA的逆转录 1.5ml的离心管混匀下列试剂(TaKaRa 公司): OligodT prime(50uM) 1μl 10mM dNTP 1μl total RNA 2-3ug DEPC水 Up to 10 μl B. 在PCR仪进行下列条件的变性,退火反应 65 ℃ 5min,冰上急冷 C.在上述管中配制下列反转录反应液: 5×First Strand buffer 4μl Rasin(40 unit/ ml) 0.5μl PrimeScript Rtase (200U/μl) 1μl RNase Free dH2O 4.5μl --------- Total 20μl D.将管子置于42℃shui水浴中反应1小