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XXX有限公司 SDS电泳的测定方法 文件编号 XXXX-02 制定部门 研发部 版本 A/0 页码 1/3 生效日期 2014/4/9 目的 建立SDS电泳的测定方法,确保电泳检测的准确性，保证电泳的安全性、有效性。 范围与权责 适用于本公司的所有成品以及中间体的分析，由化验员负责采样检测。 品控主管负责审核。 原理 SDS电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS,SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMw=k-bX。式中：Mw为分子量；X为迁移率；k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对数分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 实验仪器及试剂 DYCZ-24DN 双垂直电泳仪 DYY-8C 电泳仪电源 STS-2A 脱色摇床（水平） 标准蛋白Marker 平皿：直径150mm TEMED:四甲基乙二胺 DTT:二硫苏糖醇 储存液 ①2M Tris-HCl缓冲液：称取24.2g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至8.8，待室温，加蒸馏水至100ml。 ②1 M Tris-HCl缓冲液：称取12.1g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至6.8，待室温，加蒸馏水至100ml。 ③10%SDS溶液：称取10g SDS ，加蒸馏水溶解至100ml。 ④50%甘油：50ml甘油加50ml蒸馏水，混合均匀。 ⑤1%溴酚蓝：100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌至完全溶解，水相针式过滤器过滤除去聚合的染料。 9. 工作液 ①A液：30%丙烯酰胺储存液，丙烯酰胺是一种神经毒素，可通过皮肤被人体吸收并富集。操作时要避免皮肤接触，并带合适的口罩于通风橱中进行。 ②B液—分离胶缓冲液：取75ml 2M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，加21ml蒸馏水，混合均匀，4℃保存数月。 ③C液—浓缩胶缓冲液：取50ml 1M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，，加46ml蒸馏水，混合均匀，4℃保存数月。 ④10%APS：称取1g过硫酸铵，加10ml蒸馏水溶解后，水相针式过滤器过滤分装到EP管中， XXXX有限公司 SDS电泳的测定方法 文件编号 XXXX-02 制定部门 研发部 版本 A/0 页码 2/3 生效日期 2014/4/9 4℃保存一个月，-20摄氏度保存一年。 ⑤上样缓冲液：称取0.154g DTT，于10ml容量瓶中，加少量水溶解后，加 0.6ml 1 M Tris-HCl缓冲液，5ml 50%的甘油，1ml 1%溴酚蓝，混合均匀后定容至刻度线。 可分装至EP管保存，4℃保存一个月，-20摄氏度保存一年。 ⑥电极缓冲液：称取3g Tris，14.4g Gly，1g SDS至1L烧杯中，加1L蒸馏水溶解，搅拌均匀，室温保存。 10. 染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250，加450ml乙醇，加100ml乙酸，加水450ml，混合均匀，室温保存。 11. 脱色液：100ml乙醇，加100ml冰醋酸，加水800ml，混合均匀，室温保存。 操作步骤 1、电泳仪的组装 ①将平板玻璃和凹板玻璃重叠，用手将两块玻璃板在桌面上或是玻璃板上竖起，使两玻璃底面平齐，从而形成胶室。 ②将胶室放入主体，是凹玻璃的一面向内。若做单面胶，另一侧用单胶堵板（δ=5mm）代替。 ③插入楔形插板，用力向下按，挤紧玻璃板。 ④将主体放入原位制胶器内，手柄起立位与底座箭头对齐，两手同时把手柄向主体推动，直到推不动为止，然后开始旋转手柄，听到咔、咔两声，底座箭头指向手柄1.0mm标志处，此时楔形插板已压紧胶室，可以开始灌胶了。 2、分离胶的配制 12%分离胶（10ml） A液 B液 蒸馏水 10%APS TEMED 4ml 2.5ml 3.5ml 50μl 5μl 按上表，将A液，B液，蒸馏水先加到小烧杯中，混合均匀，再添加10%APS,TEMED后，混合均匀，迅速连续地灌到两玻板间隙中去，留出灌注浓缩胶的空间（齿长再加0.5cm），用移液枪小心加蒸馏水覆盖，直至有蒸馏水溢出，在室温或恒温箱内垂直放置30min，使其完全聚合凝固，在凝胶面与水封层之间可见清晰的分界线。 倾出蒸馏水，用滤纸条小心地吸取分离胶顶部残留的水。 3、浓缩胶的配制 5%分离胶