实验四 化妆品中细菌学检查.pdfVIP

实验十三 化妆品中铜绿假单胞菌检测 铜绿假单胞菌也称绿脓杆菌，属于假单胞菌属，在自然界广泛分布，对外环 境的抵抗力较强，为条件致病菌，可引起人的眼、耳、鼻、咽喉和皮肤等处感染， 特别是烧伤、烫伤后的感染尤为严重，常使病情恶化，并可引起败血症。该菌为 革兰阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌索为其特征。此外还能液化明胶，还 原硝酸盐为亚硝酸盐，在42 ℃条件下能生长，可与类似菌区别。 【目的意义】 1 ．掌握铜绿假单胞菌检测的主要步骤与方法。 2 ．熟悉化妆品标本的采集原则。、 3 ．掌握铜绿假单胞菌落的观察和生化反应结果的判断。 【实习时数】 3 学时。 【仪器设备和试剂】 1 ．培养基 SCDLP 液体培养基、十六烷基三甲基溴化铵培养基、乙酰胺培 养基、绿脓菌素测定用培养基、明胶培养基、硝酸盐蛋白胨水培养基、普通琼脂 斜面培养基。 2 ．仪器设备恒温培养箱，高压灭菌器，灭菌平皿，灭菌刻度吸管，接种环， 接种针，酒精灯，广口瓶，三角烧瓶等。 【操作步骤、观察与记录要求】 (一)检验程序 33 (二)检验方法 1 ．样品的前处理 (1)亲水性样品(水包油型)：可取10g 加到90ml 带玻璃珠的灭菌生理盐水中， 如样品量少于10ml，仍按10 倍稀释法进行。如为5ml 则加45ml 灭菌生理盐水， 混匀后，制成1：10 稀释液。 (2)疏水性样品(油包水型)：取样品 10g 先加 10ml 灭菌液状石蜡混匀，再加 10ml 灭菌的吐温80，在40～44 ℃水中振荡混合10min，加入灭菌生理盐水75ml ， 在 40～44 ℃水浴中乳化，制成 1：10 悬液。或用均质器，将加有助溶剂、稀释 液的样品放入均质器，均质3～5min 后，取上清液待检(上清液的稀释倍数为1： 10)。 (3)膏、霜、乳剂半固体状样品 1)亲水性的样品称取10g，加到灭菌的90ml 生理盐水的锥形瓶( 内带玻璃珠) 中，充分振荡混匀，放30～32℃水浴中静置15min，用其上清液作为1：lO 的稀 释液。 2)疏水性的样品称取 10g，放到灭菌的研钵中，加 10ml 灭菌液状石蜡，研 磨成黏稠状，再加 10ml 灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70ml 灭菌生理盐水， 在40～44 ℃水浴中充分混合，制成1：10 稀释液。 (4) 固体样品：称取 10g，加到灭菌的90ml 生理盐水稀释瓶中，振荡混匀， 34 使其分散混悬后，放 30～32℃水浴中，15min 后取出，充分振荡混合，再放到 30～32℃水浴中静置15min，取上清液作为1：10 稀释液。如有均质器，上述亲 水性膏、霜、乳剂等，可称10g 样品加90ml 灭菌生理盐水，均质1～2min;疏水 性膏、霜及眉笔、口红等，称10g 样品加90ml SCDLP 液体培养基，或1g 样品 加lml 灭菌液状石蜡、lml 灭菌吐温80、7ml 灭菌生理盐水，均质3～5min 。 2 ．增菌培养 取1：10 稀释样品10ml 加入90ml SCDLP 液体培养基中，置 37℃培养18～24h，进行增菌。如有铜绿假单胞菌生长，则培养基表面有一薄层 菌膜，培养液呈黄绿色或蓝绿色。 3 ．分离培养 从增菌培养液的菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲 基溴化铵琼脂平板上，置37℃培养18～24h，进行分离培养。此培养基具有较强 的选择性，大肠埃希菌不能生长，革兰阳性菌生长较差，而铜绿假单胞菌则生长 成扁平菌落，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，边缘不整，菌落呈灰白色，菌 落周围培养基常扩散有水溶性色素。也可用乙酰胺培养基进行分离培养，37℃培 养24h，铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整齐，菌落周 围培养基略带粉红色，其他菌不生长。 4 ．染色镜检 挑取可疑菌落，涂片，革兰染色，镜检为革兰阴性杆菌者应 进行氧化酶试验。 5 ．氧化酶试验 取一小块洁净白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑 取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上加1 滴新配制的1％二甲基 对苯二胺试剂，在15～30s 之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性； 若培养物不变色，则为氧化酶试验阴性。少数其他菌可能也有颜色反