实验十五分子毒理基础实验-体外细胞培养.pdfVIP

实验十五 分子毒理基础实验－体外细胞培养 一、实验目的 1、理解体外细胞培养的方法。 2、掌握体外细胞培养的操作。 二、实验原理 1、组织细胞培养的发展史： 人们对组织和细胞的研究经历了四个世纪，其中组织培养是伴随着移植医学及 病毒学的发展而开展起来的，经过了三个阶段。 早期培养：1885 年德国人 Roux 首先尝试用温生理盐水培育鸡胚神经板组织数 月，且第一次采用“Tissue culture”这个名词。1898 年 Ljunggren 将人体皮 肤保存在腹水中几天至几周后再作移植手术获得成功。这些工作为后来组织培养 方法的建立和发展提供了依据。 组织细胞培养的建立与发展：美国生物学家Harrison(1907）采用单盖片覆盖 凹窝玻璃的悬滴培养法，以淋巴液为培养基，观察了蛙胚神经细胞突起的生长过 程，首创了体外组织培养法。Maximow(1925)年将单盖片悬滴培养法改良为双盖 片培养法，虽然悬滴培养法操作简便，但细胞生长空间狭小，气体不足，培养基 少，细胞易老化，需经常更换培养基，因而易污染。 美国生物学家 Carrel（1923）设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织细胞的生存 空间，且换液传代方便，减少了污染机会。Dulbecco 和 Moscona 等采用胰蛋白 酶消化和液体培养基获得了单层细胞，确定了细胞培养法。 现代组织细胞培养：50 年代末组织技术进入繁盛阶段。1950 年，在美国遇到 大规模开发脊髓灰质炎疫苗的机会，利用组织培养法，并加以改良简化，使研究 培养更加普遍广泛。随着各种仪器设备的开发研究、培养基等各种试剂的商品化， 组织培养已日益成为生物工程的生产手段。 2、体外培养细胞的分型 根据离体细胞在瓶皿中生长时是否贴壁的性质，将其分为贴壁型与悬浮型两 类。 贴壁型细胞：培养细胞需贴附在支持物上生长，也称锚着依存性细胞 （anchorage-dependent cells），大多数细胞属此型。细胞贴壁后，分化现象常 变得不显著，易失去原有组织性，形态上表现单一化。 依据细胞来源大致分为： （1）上皮细胞型：细胞呈扁平不规则多角形，中间有胞核，彼此紧密相连成单 层膜，此类细胞多来源于内、外胚层。例：消化道上皮、肝、胰、肺泡上皮细胞 等。 （2）成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，胞质向外伸出 2~3 个长短不 同的突起，此类细胞多来源于中胚层。例：心肌、平滑肌、血管内皮细胞等。 （3）游走细胞型：细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，贴附 于支持物上散在生长，一般不连接成片。但其形状很不稳定，有时与上皮样细胞 或成纤维细胞难以区别。例：神经细胞、巨噬细胞。 悬浮型细胞：某些细胞呈悬浮状态生长，在瓶皿内不贴壁，其生存空间大， 能繁殖大量细胞，容易进行传代培养，但在观察细胞病变时不如贴壁细胞。例： 淋巴细胞白细胞、某些肿瘤细胞。 三、操作步骤 1、细胞计数 取清洗干净的血球计数板放在显微镜下检查，以确定计数板上没有杂质，否 则影响细胞计数结果；用吸管混匀待计数细胞悬液，取0.1ml悬液+ 0.8ml Hanks+ 0.1ml 0.3%台盼蓝（死细胞着色），混合后滴入血球计数板；沉降 1 分钟，按白 细胞计数法计数四大中方格内的活细胞（透明末着色）总数，然后用下式计数： 细胞浓度（细胞数/ ml）=（四大中方格细胞数/4）×104×稀释倍数（10） 细胞存活率=活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%（计数时，如果细胞压在 格上，则数上不数下，数左不数右）；除用台盼蓝染色，检测活细胞和死细胞， 还可用：0.05%苯胺黑和0.1%结晶紫。 2．细胞的分装、培养及传代 根据实验需要，参考相关文献进行操作。 3．细胞的冻存、复苏与运输 细胞冻存和复苏的基本原则是慢冻快融。 （1）冻存 用含20%小牛血清培养液配制浓度为20%的DMSO（二甲亚砜）冻存液；调节 细胞数为1×104~1×107，1000转/ min离心20秒，去上清。弹指法分散沉淀， 左手摇动离心管，右手逐滴加入与细胞悬液等量的DMSO冻存液；取1 ml分装在 2 ml 冷冻管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期，用白布包扎冷冻管（管 口朝上）；梯度降温冻存，标准的冷冻下降速度：为1~2℃/min，当温度降至-30 ℃时，再以5~10℃/min的速度下降，降至-100℃时投入液氮中。 也可采用：冷冻管置4℃，30min→冰水中10