向日葵霜霉病菌检疫鉴定方法.doc

前 言 本标准由内蒙古出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：内蒙古出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院 本标准主要起草人：杨永生、郭铁筝、董奇彪、严进、张永宏、赵治国、刘玮琦、杭小溪。 本标准的附录A、B为资料性附录。 本标准不涉及任何专利信息。 向日葵霜霉病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了向日葵霜霉病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于向日葵种子、植株上霜霉病菌的检疫鉴定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用 文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 原理 分类地位Plasmopara halstedii (Farl.)Berl. de Tonii 异名 Plasmopara helianthi Novot 英文病名 Downy mildew of sunflower 病原分类地位：藻菌界Chromista，卵菌门Oomycota，霜霉目Peronosporales，霜霉科Peronosporaceae，单轴霜霉属Plasmopara。 鉴定依据 向日葵以卵孢子在土壤、病残体和种子上中越冬。种子带菌作为远距离传播的途径。卵孢子萌发产生游动孢子囊，释放出游动孢子侵入向日葵，形成侵染症状。初侵染发病的植株的叶背产生的霉层可进行再侵染该病菌的寄主范围及其在寄主上的危害症状、菌形态特征等作为本标准的鉴定依据。术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 菌丝：大多数真菌在生长过程中产生茂盛分枝的管状细丝，一条管状细丝称菌丝。真菌的结构单位多条菌丝聚集在一起称菌丝体 孢囊梗：从营养菌丝分化出着生孢子囊的分枝或不分枝的菌丝。 孢子囊：由孢囊梗的顶端膨大而成的囊状物是霜霉目等真菌的无性繁殖结构。 卵孢子真菌中卵菌从受精的卵球发展成的休眠孢子。 仪器用具及试剂 仪器用具：人工培养箱、高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜、解剖镜。解剖刀、昆虫针和小镊子、凹玻片、酒精灯、烧杯、培养皿 试剂：乳酚油、棉蓝一藏花红液、95%酒精、15%KOH、次氯酸钠溶液乳酚油配方苯酚20 m、甘油40 m、乳酸20 m、蒸馏水20 m。棉蓝—藏花红染色液配方乳酸8 m、2%棉蓝液1 m、2%藏花红液1 m、冰醋酸2m、95%酒精2 m,按顺序加入混匀。 从现场检验采集的植株按照症状判断是否为向日葵霜霉病，并编号、照相。选取典型病斑，装入密封的塑料袋带回实验室检验。 实验室检验 ，移于载玻片中央的水滴中，盖盖片镜。将带症状的植病株进行解剖检查，取每棵植株的主根、侧根、茎基、茎中和茎顶部的表皮、木质部、髓部，用15%KOH浸泡一周后，制成玻片在显微镜下检查种子检疫 样品制备 从受检向日葵果实中挑选瘪小粒。将挑选出的样品的果皮剥开，将果皮与种子放在玻璃容器内。 透明 加乳酚油没过受检样品，放在电炉或酒精灯上加热，煮沸3，室温下自然冷却(该过程必须在毒气橱或通气良好的环境中进行)。 染色 将冷却了的样品放在载玻片上，在实体镜下，用解剖针和镊子取下种皮和内果皮。用滤纸吸去多余的乳酚油，将种皮和内果皮放人凹玻片内滴加棉蓝—藏花红染色液24滴，于室温下放置424h，其间翻动样品12次。 制片 用95%乙醇数滴冲洗，将种皮和内果皮分别放在载玻片上，加盖玻片。 镜检 将制成的玻片放在普通光学显微镜100400倍视野观察。 向日葵霜霉病是系统性病害，病菌可侵染植株根、茎、叶、花和果实。在田间发生从幼苗至成株都有症状表现。可引起幼苗倒，植株矮化，叶片畸型皱缩，有的产生局部病斑，根、茎基部产生菌瘿。叶片局部侵染是病菌在田间的再侵染所造成，植株长势如正常株，仅叶片上出现淡绿色至黄色小型角斑或沿叶脉褪绿黄斑，其背面生白色霉层，可形成花盘并开花结实。若样品带有霜霉病菌，则可见霜霉菌菌丝体和吸器染色蓝色(深蓝或浅蓝)，寄主细胞染成亮粉红菌丝在寄主细胞间扩展，无隔膜，宽4.414.5μm；吸器球形或近球形，伸进寄主细胞内，直径5-10μm。 在显微镜下观察到种子里的菌丝无隔，沿细胞间扩展，走向清晰，菌丝宽4.414.5μm，吸器呈球形或近球形，平均直径7.2μm。向日葵霜霉菌的菌丛白色或淡黄色厚密生于叶背囊梗单枝或24枝从气孔伸出，无色透明，有隔膜，细长，2530~809.6×7.6~12.6μm。在囊梗先端3/51/5处呈单轴近直角分枝24次，末端分枝15个，直、短圆锥形，常簇生成直角，5.113.8 ×2.0~3.4(~4.3) μm。末枝先端钝或作细微八字形，其上顶生子囊。子囊无色透明，椭圆形、卵圆形或近球形，顶部有一浅乳突，子囊大小(16.4)19.0~32.9(~35.4) ×15.2~25.0(~27.8) μm。子囊在自来水或蒸馏水中萌发产生双鞭毛