氧化还原对NDPK-A及突变体磷酸转移酶活性的影响.pdfVIP

量指教术il粮 ·研究报告· BIOTECHNOWGY BULLET1N 2012年第6期 氧化还原对NDPK-A 及突变体磷酸转移酶活性的影响 张志红吕芬高雪杨依丽罗勇熊盛 {暨南大学生命科学技术学院生物医药研究开发基地，广州 510632 ) 摘 要: 对核等二磷酸激酶A (NDPK-A) 及其4 种半腕氨.突变体进行诱导表选及纯化，测定它们在氧化还原条件及 正常条件下的磷酸转移鳝活性，研究氧化还原及二硫键异构对NDPK-A 及突变体活性的影响。将实验室之前构建成功的野生 型 NDPK-A ( PBV-NDPK-A) 及4 种突变型 NDPK-A 基因 (PBV-NDPK-A C45 , PBV-NDPK-A CI仰5， PBV-NDPK-A C145S , PBV- NDPK-A C4/109/1455) 在大肠杆菌中高效表达;以 DEAE咽pharose Fast F1侧离子交换层析与 Cibacron Blue 3GA Sephar田e CL-4B 亲和层析技术纯化目的蛋白; HPLC 法测定比较野生型 NDPK-A 及突变体在氧化还原和丘常环境下磷酸转移梅活性。结果显示， NDPK-A 及突变体在大肠轩萄中高效农边;经纯化分别获得了均-的 NDPK-A 蛋白及突变体蛋白，纯度均达到 98%; 在还原环境 r NDPK-A ，1.突变体的磷政转移踌活性均高于正常环境下的活性，但是在氧化环境下的磷酸转移酶活性明显低于正常环境下。氧 化还原环境对NDPK-A 结构异构及磷酸转移酶活性有-定的影响，提示氧化还原环境可能调控NDPK-A 二硫键的形成，影响蛋白 的聚集状态，从而影响蛋白的囔峻转移酶活，撞，并且 NDPK-A 结构中可能有更为复杂的氧化还原调控酶活性机制。 关键词 z 核等二磷酸激Ij A 氧化还原 磷酸转移酶活性 Effect of the Redox 00 Phosphotransferase Actixity of NDPK-A and 1臼 Mutants Zhang Zhihong Lü Fen Gao Xue Yang Yi Li Luo Yong Xiong Sheng ( Biomedical Research and Deve如Pment Center, College oflife Scie，阳and Techrwlogy, Jinan University, Gua咿MU 510632) Abstracl: 1t was to express and purify nucleoside diphosphate kinase A (NDPK-A) and its cysleine mutants, measure their phosphotrar回ferase 配tivity under the redox and normal conditions，皿d study 耻influence of redox and disulfide bond on ph咽pbotransfera皿 activity of NDPK-A and its mutants. Wide type NDPK-A 朋d its mutan国 proteins w，盯eexpr回回d in E.coli and purified by DEAE-sepharo回 Fast Flow 皿d Cibacron Blue 3GA Sepharo回 CL-4B， and 由eir ph倒photr田18fer，晶e 皿tivity under the redox 皿d normal conditions were detected hy reverse high 阳formance liquid chromatography (HPLC ) . Rult. showed that NDPK-A and its mutants were expreooed in E.coli efficiently, 由e homogeneous recomhination p