RT-PCR中引物的选择指南.pdf

RT-PCR 中引物的选择指南 一.用于 RT-PCR 的引物 1.特异性引物（跨内含子设计引物） 2.随机引物（Random primer） 3. oligo(dT)引物 二.反转录酶 M-MULV 和 AMV 三.常用内参引物的参考序列 一．用于 RT-PCR 的引物 一般做 RT-PCR 进行第一链 cDNA 合成的起始可以使用特异性引物、随机引物（Random primer）、oligo(dT)三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成 cDNA 的量、种类及 效果（如表一）。 1.特异性引物（跨内含子设计引物） 对于 RT-PCR，引物设计质量影响 RT 的结果，而且不同引物退火温度本来就不相同，所以 第一链 cDNA 合成不推荐使用。但是如果以 RNA 为模板进行一步法检测基因表达情况，一般建 议添加特异性引物，这样设计的主要目的是消除 RT-PCR 时基因组 DNA 污染对结果的影响。跨 内含子设计引物有两种做法（如下图A 和 B）： 1.1 在两个不同的外显子上设计引物，上下引物分别位于不同的外显子上 这样从和 cDNA 和基因组 DNA 中扩增的片段大小不同(基因组 DNA 中的包含内含子扩增的 要大些)，从而可以通过用合适的延伸时间来限制基因组中大片段的扩增，消除基因组 DNA 污染 的影响(这要求跨越的内含子要大些)。 1.2 上游或者下游引物或者两者，引物本身在两个不同的外显子上 注意引物在两个外显子上分布，在“ 内侧”要少些，少于 8bp 左右。这样的引物就不能从基因 组 DNA 扩增，从而消除基因组 DNA 污染的影响(这要求目的基因具有较多的外显子，从而有较 多的选择，引物本身质量可能不好。 2.随机引物（Random primer） 在两步法 RT-PCR 中，mRNA 必须先转录为 cDNA 。在这种情况下，采用不依赖序列的引 物，例如随机引物和 oligo(dT)引物。 随机引物，一般指的是多个任意的碱基连接而成的一套寡聚引物组，常见的是 random （6 ），random （9 ），random （10），如果6 个碱基的随机序列，则是 5’-d （NNNNNN）-3’，共有4 6 条引物。 原核生物由于没有 poly(A)，因此在进行总 mRNA 的 RT 时要用到随机引物，由于其比较短 小，且随机组合丰富，所以在 mRNA 上的结合也很多，产生短的，部分长度的 cDNA，因此也 可以进行有效的 RT。这种方法经常用于获取5’末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶 不能复制的终止位点的 RNA 模板获得 cDNA。因此一般适用于长的或具有发卡结构的 RNA；适 用于 rRNA、mRNA、tRNA 等所有单一模板 RNA 的反转录反应。在 RT-PCR 用随机引物制备 CDNA 时，要去除总 RNA 中的tRNA 、rRNA，只保留 mRNA。 因为体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，所以随机引物法是三种方法中特 异性最低的，通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。所以随机引物介导制备的cDNA 产物复杂程度高，从而降低了后续 PCR 反应的敏感度和特异性。为了获得最长的 cDNA，需要 按经验确定每个 RNA 样品中引物与 RNA 的比例。随机引物的起始浓度范围为 50 到 250ng 每 20μl 反应体系。 2.1 随机引物优先应用范围： ü RT-PCR 实验中，合成带有或不带有 poly （A ）的cDNA 。 ü 长片断的 mRNA5’—区域的 RT –PCR。 ü 模板 RNA 具有较多二级结构的 CDNA 的合成。 ü 可用于 Northern/Southern 杂交、原位杂交和克隆／噬菌斑杂交的标记探针。mRNA 差异显示。 ü 病毒鉴定，因为大多数病毒的序列是未知的，所以在 RNA 病毒的研究中一般用随机引物进行扩 增并进行鉴定。 3. oligo(dT)引物： Oligo(dT)一般指的是多个 T 碱基连接而成的寡聚引物，主要是针对真核生物具有 Poly(A)尾 时设计的用于 RT，因此 RT-PCR Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。因为 poly(A)+RNA 大概 占总RNA 的