基因表达与蛋.pptVIP

尝试用 Urea gradient / Gel filtration来解决 * 尽快用0.1 N HCl冲洗 * 用0.1 N NaOH / 0.1% SDS洗 * 主要是溶氧量的问题, 可以通过在摇瓶中加入不同量的培养基的方式来确定最佳体积 * 目前我实验过程中碰到的问题 未检测到蛋白表达 质粒是否成功转化到宿主菌，是否质粒丢失/不稳定？ 诱导条件需要优化 稀有密码子问题 载体/表达菌不合适 mRNA二级结构是否不利于表达 蛋白性质所致（如疏水性很强，或糖基化位点多，或蛋白毒性较大） 缺少SD序列或者不合理，或者被其它二级结构掩埋 检查构建载体的启动子下游的SD序列，是否在插入表达基因时被切掉了或形成二级结构。 * THANK YOU ! * （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 原核表达操作步骤 * （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 * 1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 * 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中，37℃震荡培养至OD600 ≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3hr）。3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3hr。4、分别取菌体1ml，离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀，70℃10min。5、离心12000g×1min，取上清作为样品，可做SDS等分析。 （四）诱 导 表 达 * ? 重组蛋白可在E.coli、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达，其表达形式一般可分为： （1）细胞外的分泌表达； （2）细胞内可溶性表达； （3）细胞内不溶性表达，即产物以包涵体的形式存在。 重组蛋白的表达形式 * SDS（秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A* 基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008） * SDS（秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A* 基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008） * SDS（秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A* 基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008） * SDS（秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A* 基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008） * SDS（秦 伟等，水稻密码子优化的cry2A* 基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化，生物工程，2008） * 按蛋白质类型分 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达: pel/ompT分泌肽 按启动子分 lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导 lamda phage PL和PR 启动子 热诱导 T7 启动子 IPTG诱导 T5 启动子 IPTG诱导 ara启动子 阿拉伯糖诱导 大肠杆菌表达载体分类 * pJLA50X系列; pcDNAII; e