第6节酶活力测定及酶的分离纯化.pptVIP

测定酶活的方法： 终点法: 测定完成一定量反应所用时间。 动力学法:测定一定时间所起的化学反应量。  酶活力的表示方法 酶的分离提纯 1、基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变性，操作中加入缓冲溶液. 2、基本操作程序： 酶制剂纯度的主要指标是： A.蛋白质的浓度?? B.酶的总量?? C.酶的总活性?? D.酶的比活性 下列哪项条件适合保存酶制剂？ A.0℃闭光?? B.室温闭光?? C.-20 ℃闭光? D.室温光照 作 业 P107思考题 1、5、6、7 第七节 酶工程简介 本章内容结束，谢谢！ * * * * （一）酶的活力测定 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力可以用在一定条件下所催化的某一反应的反应速度来表示，两者呈线性关系。 10 20 30 40 50 60 min 产物生成量 酶反应进程曲线 酶的活力测定和分离纯化 用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速度. （二）酶活力的测定方法 1.分光光度法 利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择一适当的波长，测定反应过程中反应进行的情况。 优点：简便、节省时间和样品，可检测到nmol/L水平的变化。 2.荧光法 主要是根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定。 3.同位素测定方法 4.电化学方法 活力单位（active unit） 习惯单位（U）: 底物(或产物)变化量 / 单位时间 国际单位（IU）: 1μmoL变化量 / 分钟 Katal（Kat）：1moL变化量 / 秒 比活力= 总活力单位 总蛋白mg数 = U(或IU) mg蛋白 量度酶催化能力大小 转换系数（Kcat） 底物（ μ moL）/ 秒·每个酶分子 量度酶纯度 比活力（specific activity） 量度转换效率 选材 抽提 分离 纯化 微生物、动物、植物 加入提取液抽提 胞内酶先破碎 先净化处理 再沉淀法分离 离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等 酶的保存：1.低温（0-4℃)；2.高浓度较稳定； 3.加入稳定剂； 4.固定化。 酶的固定化就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。 1、吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。 2、包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。 3、偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。 4、交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“网状”结构。 D A 一、酶工程的概念: 酶工程：是指酶制剂在工业上的大规模生产及应用。 1971年第一届国际酶工程会议上得到命名。主要研究：酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造及其在工、农、医药等领域的应用。 天然酶在开发和应用方面受到限制： 1.酶的不稳定性 2.酶的分离、纯化较难，成本高，价格贵 目前在酶的应用方面所采取的一般方法： 1. 化学方法：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和降低成本，或通过化学合成法制造人工酶。 2. 利用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，生产出性能稳定、具有新的生物活性以及催化效率更高的酶。 二、化学酶工程 化学酶工程亦称初级酶工程： 指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。 1.天然酶 主要指工业用酶，从微生物发酵得到的酶。如：洗涤剂、皮革生产中用的蛋白酶；纸张制造用的淀粉酶；乳制品用的凝乳酶等。 2.化学修饰酶：用于医药及研究工作，通过 （1）化学修饰酶的功能基 ； （2）通过交联反应； （3）大分子修饰作用 3.固定化酶：将水溶性酶用物理或化学方法，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。 4.人工模拟酶—化学法合成酶（已知酶的活性中心和作用机理）。 三、生物酶工程 生物酶工程的主要内容： 克隆酶—用基因工程技术大量生产酶（ ? -淀粉酶，青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶） 突变酶—对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶 制造新酶—设计新酶基因，合成自然界不曾有过的酶 生物酶工程亦称高级酶工程 是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。 四、抗体酶 抗体酶—指专一于抗原分子的， 具有催化活性的免疫球蛋白，即在其高可变区赋予了酶的属性。