免疫细胞及细胞因子的检测.ppt

* 第十三章 免疫细胞及细胞因子的检测 免疫缺陷症 自身免疫病 肿瘤 淋巴细胞或淋巴细胞亚群的数量和功能的变化 机体细胞免疫水平 第一节 免疫细胞的分离与纯化 外周血的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板，可根据它们的理化特性，如细胞大小、密度、表面电荷和粘附能力等存在差异，分离不同的细胞群体。但淋巴细胞理化特性与其它细胞差异甚微，不容易分纯，所以产生了专门的淋巴细胞分离纯化技术，旨在于获得高纯度、高收率和高活性的不同类型和不同亚群特点的淋巴细胞。 一、白细胞分离：自然沉降法 红细胞密度1.093 白细胞密度1.092 灰白层 二、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞（PBMC）：包括淋巴细胞和单核细胞。 红细胞密度1.093 粒细胞密度1.092 单个核细胞密度1.075-1.090 血小板密度1.030-1.035 密度为1.075-1.092的等渗分离溶液 离心 可分离各种血细胞和单个核细胞 分离溶液的基本要求： ① 对细胞无毒； ② 基本等渗； ③ 不溶于血浆等分离物质； ④ 有一定的比重。 较理想的细胞分层液：聚蔗糖—泛影葡胺，商品名为：Ficoll Ficoll分离液法：单次差速密度梯度离心的分离法。 方法： 1、细胞分层液置试管底层； 2、将肝素抗凝全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面； 3、水平式离心； 4、离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带（见图） 本法分离的单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%~95%，细胞收率可达80%以上，但室温超过25℃时可影响细胞收率。 用Percoll原液（密度1.135）与约等量的磷酸缓冲液均匀混合，经高速离心后，可使分离液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，再将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在液面上，低速离心后，便得四个细胞层。（见图） 三、淋巴细胞的纯化与亚群的分离 （一）淋巴细胞的纯化 1、贴壁粘附法：利用单核细胞贴壁生长的特点；B细胞会有所损失。 2、吸附柱过滤法：同样利用单核细胞具有贴壁生长的特点，粘附能力为：巨噬细胞或单核细胞树突细胞B细胞T细胞=红细胞。 3、磁铁吸引法：利用单核细胞县有吞噬的特性，加入直径为3μm的羰基铁颗粒。 （二）、淋巴细胞亚群的分离 1、E花环沉降法：基本原理是利用T细胞有羊红细胞受体（E受体），可以与羊红细胞结合形成较大的E花环的特性，可将T细胞和B细胞分离。 2、尼龙毛柱分离法：利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，将T细胞和B细胞分离。 3、亲和板结合分离法：利用亲和层析和抗体固相包被原理。 第二节 淋巴细胞数量的检测 一、T淋巴细胞数量的检测 （一）、免疫荧光法：直接法、间接法 （二）、酶免疫组织化学法：以酶作为抗体标记物→细胞酶免疫组化 生物素——链霉亲和素放大系统提高灵敏度 （三）、花环技术 1、E花环试验 2、抗体致敏花环法 用相应的抗CD3单克隆抗体吸附于醛化的红细胞（致敏）+受检细胞→抗原抗体反应→受检细胞周围粘附3个或3个以上红细胞为花环形成细胞，计算花环形成细胞与计数淋巴细胞之比。（见图） E花环试验结果示意图 二、B淋巴细胞数量的检测 （一）、CD抗原的检测 （二）、SmIg的检测：鉴定B细胞可靠的指标。 第三节 淋巴细胞功能的检测 淋巴细胞功能测定是在免疫缺陷病及多种疾病的发病机制、疗效判断、免疫治疗及预后的重要依据。可分为体内实验和体外实验。 一、T淋巴细胞功能的检测 1、淋巴细胞转化实验 刺激物 基本原理：T细胞敏感刺激物在体外刺激T细胞→T细胞增殖、转化→根据其增殖转化能力评定相应的细胞功能。 非特异性 特异性 ①形态法 外周血或单个核细胞+刺激物————→涂片染色镜检 参考值：60%~80%，小于50%视为降低。 评价：方法简便易行，受主观因素影响大。 37℃培养 72小时 ②放射性核素法 外周血或单个核细胞+刺激物 加适量3H-TdR 记录每分钟脉冲数（cpm） SI=PHA刺激管cpm均值/空白对照管cpm均值。 评价：结果客观，但价格昂贵，有放射性核素污染。 37℃培养 56小时 培养16小时 ③MTT比色法 外周血或单个核细胞+刺激物————→加适量MTT混匀————→比色法测OD值。 评价：方法敏感、简单、快速、无污染。 37℃培养 70小时 培养4~6小时 二、B淋巴细胞功能的检测 临床常检测各类抗体 B细胞的功能． 对于免疫缺陷患者或科研实验时： ①反向溶血空斑试验：检测人类Ig分泌细胞.　淋巴细胞+SPA-SRBC+抗人Ig抗体+补体